生物化学-实验题

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1、•蛋白质、核酸大分子分离、纯化1、生物材料的选择：（1）含量丰富⑵易于处理和提収2、生物材料的破碎和预处理组织匀浆法，研磨3、粗分离离心、盐析、有机溶剂沉淀、胶体吸附等4、纯化各种层析技术【离子交换层析、亲和层析技术（比较贵，一般要求纯化到95%以上时才使用）】5、产物的浓缩干燥和保存6、鉴左⑴物理化学性质鉴定⑵生物活性鉴定>蛋白质的理化性质蛋白质的分子量2、蛋白质的两性解离和等电点3、蛋白质的交替性质4、蛋白质的沉淀5、蛋白质的呈色反应6、蛋白质的紫外吸收7、蛋白质的变性与复性>蛋白质分子分离纯化的一般原理1、分子大小不同

2、层析、透析、超滤、电泳2、溶解度不同盐析、等点沉淀、有机溶剂沉淀3、所带电荷不同电泳、离子交换层析4、对配基的特异性酶和特异性蛋白（亲和层析）例：盐析法的一般原理原理：通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各种成分分步“盐析”出来，达到分离蛋白质的目的，是粗分离蛋白质的重要方法Z-o优点：操作简单，经济实用【目前（NH4）2SO4最为广泛，其优点：溶解度大；不受温度影响；对蛋白质的活性没有影响;分离效果好，纯度可提高5倍；经济实用】>DNA的性质1、DNA呈酸性，易溶于微碱性溶液中，但不溶于有机溶剂（用冷乙醇沉淀）2、DNA

3、分子很长，溶液呈粘稠状3、DNA分子本身具有刚性，易受剪切力的作用4、DNA易受DNA酶作用而降解加入SDS（蛋白质变性剂，抑制酶的活性），EDTA—柠檬酸溶液5、DNA的变性与复性6、紫外吸收（260nm）>DNA的制备原理1、DNA蛋白和RNA蛋白在不同的盐溶液中的溶解度不同：DNA蛋白溶于高盐，RNA蛋白溶于低盐，使用高速冷冻离心机2、蛋白质的变性：氯仿，抽提3、DNA不溶于有机溶剂：用95%的冷乙醇提炼核蛋白a低盐溶液（反复离心）RNA核蛋白DNA乙醇沉淀DNA核蛋白砂th提蛋白质纯化的DNA/主要杂质：蛋白质和RN

4、A•蛋白质、核酸的含量测定一、蛋白质的含量测定凯式定氮法蛋白质中氮元素含量大约是16%,蛋白质含量二含氮量*6.252、双缩腺法（分光光度法）双缩腺是由两分子尿素缩合成的化合物，分子中的两个（CO-NH）在碱性溶液中能与Ci?•反应生成紫红色络合物。该反应稳定，操作简便，但灵敏度较低，适于测定蛋白质浓度较高的样品（l-10mg/ml）o3、Folin—酚Folin-酚试剂法（Lorry法）是测定可溶性蛋白的标准方法。该法是在双缩腺反应基础上，再加入酚试剂（含磷铝酸及磷钩酸）进一步反应。蛋片质酪氨酸酚疑基将酚试剂还原成蓝色化合

5、物（钮蓝和钩蓝的混合物）,因而可使反应灵敏度提高一个数量级。4、考马斯亮蓝法考马斯蓝分子通过范徳华力、疏水作用和静电力可与蛋白质进行物理结合。结合后的考马斯蓝颜色繁盛变化，通过比色可定量蛋白质。此法操作简单，反应灵敏，可测微克量级蛋白质样品。有不同类型的考马斯蓝：考马斯蓝R-250和考马斯蓝G-250o由于R-250比G-250灵敏，常用于电泳凝胶的蛋白质染色。在蛋白质浓度髙时，R-250显色不符合Beer定律，因此常用G-250定量溶液屮的蛋白质。利用考马斯蓝G-250结合法定量蛋白质又叫Bradfold法。5、紫外分光光

6、谱法是通过测定在280nm处光吸收值完成的。蛋白质中含有Tyr,Trp,Phe。该法测定快速，而且测定后样品不损失，常用于蛋白质纯化过程中洗脱峰的检测。二、核酸含量的测定1>定磷法2、定糖法3、紫外分光光度（共辄双键）>光谱分析技术（分光光度计）722型光吸收定律（Lanbert-Beer）（光密度）0D二KCL光被吸收的量度与溶液的浓度与液层的厚度成正比，K为消光系数；L比色杯厚度lcm；C摩尔浓度。■层析技术一、原理：由于被分离的混合物各组分的物理化学性质不同，当通过一个互不相容的两相（固定相和流动相）组成的体系，各组分

7、在两相间的分配不同，且随流动相向前移动，各组分不断地两相中进行再分配。分部收集出液，可得到样品中所含的各单--组分，从而达到将各组分分离的日的。二、分类1、吸附层析效果不是很好，利用吸附力不同。2、分配层析操作麻烦，利用溶解度不同3、离子交换层析利用所带电荷不同，静电引力不同4、凝胶层析根据蛋白质分子大小不同；固相凝胶具有分子筛作用。5、亲和层析比较贵，但是分离效果好，一般用于核酸分离>凝胶层析原理利用固定相具有网眼的海绵状基质构成一定大小的网孔对流动相屮被分离物质相对分子质量不同分离的层析技术。具有分子筛效应的凝胶有4种：

8、1、葡聚糖2、琼脂糖核酸配合电泳3、聚丙烯酰胺蛋白质配合电泳4.玻璃球凝胶也用于蛋H质盐析后除盐凝胶层析的操作步骤：1、胶的选择：75g以下叫硬胶。2、制胶：使用前必须水化（温水浸泡；煮沸）3、灌柱：柱要直；要均匀，不能进空气；注意柱长与样品比例；柱面要平整（做到柱面平整，需要连续灌柱）4