蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展

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1、蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展摘要：植物蛋白酶抑制剂是除Bt之外又一个愈来愈研究较多的抗虫基因资源，其分布广泛，在豆科、茄科、禾本科、葫芦科及十字花科等植物屮存在较多。植物蛋白酶抑制剂抗虫基因主要通过2种途径获得并在多种植物中进行转化，获得抗虫转基因植株。植物蛋白酶抑制剂在基因工程中的应用已有很大的发现进展。关键字:蛋白酶抑制剂基因作用机理转基因正文:一蛋白酶抑制剂作用机理广泛存在于植物组织屮的蛋口酶抑制剂是一种多肽物质，对许多昆虫有防卫作用。该基因及其编码区域较小、没有内含子。研究表明，这些蛋白酶抑制剂在植物对危害昆虫以及病原体侵染的夭然防御

2、系统中担当着重要角色。昆虫饲喂实验发现，某些纯化的蛋白酶抑制剂具有明显的抗虫作用。利用蛋白酶抑制剂基因来提高植物的抗虫能力，已成为植物基因工程研究的一个热门领域。在植物中发现有三类蛋口酶抑制剂：丝氨酸蛋口酶抑制剂，琉基蛋口酶抑制剂和金属蛋口酶抑制剂。其中对丝氨酸类蛋白酶抑制剂的研究最为透彻，目前在植物中至少己经发现有6个家族，其中的弧豆胰蛋白酶抑制剂，马铃薯蛋白酶抑制剂兀的抗虫效果最为理想。蛋白酶抑制剂的杀虫机理蛋白酶抑制剂杀虫的机理在于：它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用形成酶抑制剂复合物（E1）阻断或减弱消化酶的蛋口水解作用。所以，一旦昆虫摄

3、食进蛋口酶抑制剂，就会影响外來蛋口的正常消化，同时，蛋白酶抑制剂和消化酶形成E1复合物，能刺激消化酶的过量分泌，通过神经系统的反馈，使昆虫产生厌食反应。由于蛋白酶抑制剂抑制了昆虫的进食及消化过程，不可避免地将导致昆虫缺乏代谢中必需的氨基酸，最终造成昆虫的非正常发育或死亡。二植物蛋白酶抑制剂基因作用机理及获得的途径蛋白酶抑制剂基因的作用机理及其应用蛋白酶抑制剂（P1）是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一，存在于所有生命体中。国内外有关抗虫的植物蛋白酶抑制剂基因的获得大多通过2种途径。一种通过从植物不同部位的组织或细胞中提取抗虫活性蛋白，然后分析其起作用的

4、活性核昔酸序列，继而克隆和转化到寄主细胞，进行筛选和选育抗虫树种。利用该方法获得抗虫树种的研究越来越多，该方法中最为关键的环节是蛋白酶抑制剂提取和活性测定方法的选择和建立。植物蛋白酶抑制剂分离和纯化的策略主要依据不同植物中的蛋白酶抑制剂生理生min,化的性质和特点，设计试验方案和步骤。植物蛋白酶抑制剂属于分子量较小的蛋白质或多肽，在分离和纯化时主要利用其溶解度、分子量、电荷、等电点等性质,单独或联合使用几种如梯度洗脱、分子筛层析、亲利层析、电泳等经典技术，达到分离和纯化的口的。但不同植物蛋口酶抑制剂的分子量、电荷等特性有差异，在分离不同植物蛋白酶抑制

5、剂时所选用的层析介质、缓冲液的pH和浓度大小、电泳时的分离胶和浓缩胶的浓度和交联度都有差别，这些均需要通过深入了解不同植物来源蛋白酶抑制剂的特性设计相应的试验技术。就目前已提取的蛋白酶抑制剂而言，大多数蛋白酶抑制剂都具有耐热性和相对分子量小的特点。从水稻种子屮提取的水稻筑基蛋口酶抑制剂，其分子质量为12.Oku,在100°C下温浴30min,其抑制活性没有改变；曾仲奎等分离水稻种子获得的毓基蛋白酶抑制剂也具有该特点，证实了Abe等试验结果的可靠性，而后乂分别从玉米、百合、小麦等农作物中分离到了疏基蛋白酶抑制剂，获得了一致的试验结果。从防己科植物波叶青

6、牛胆分离到一种胰蛋白酶抑制剂(TCTT),其相对分子量为10.0kd,在100oC下加热60min,仍保持93%的抑制活性；王从海芋、从花生屮均分离到朕蛋口酶抑制剂，并证实了丝氨酸蛋白酶抑制剂也具有上述特点。基于蛋白酶抑制剂的特点，在其分离时大多数研究者采用对蛋白酶抑制剂提取液加热的方法以除去大量不耐高温的杂蛋白，从而极大地简化了试验步骤。为获得较纯的蛋白酶抑制剂样品，目前通过HPLC、RP.HPLC和FPLC色谱研究方法越来越多，极人地提高了样品的纯度，为获得蛋口酶抑制剂的结晶和研究其空间结构及特性提供了技术保障。有关蛋白酶抑制剂活性测定，传统的方

7、法主耍利用酶和抑制剂作用的动力学测定法，但该方法的缺点是花费时间长，试验条件不易控制，容易造成试验误差。近年来随着电泳技术的日臻完善，新的快速、准确的鉴定方法应运而生，应用一种快速聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定了蛋白酶抑制剂，应用SDS-PAGE一明胶电泳检测了植物蛋口酶抑制剂。该方法主要根据特异植物蛋口酶抑制剂抑制靶蛋口酶的作用从而阻止水解的原理，借助明胶一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，经蛋白酶水解后，用考马斯亮蓝染色；是一种简便、直观、灵敏的检测蛋白酶抑制剂活性的方法，该方法还可以进行大量样品的筛选工作，极大地加快了蛋白酶抑制剂的活性测定。另-•种获得植物

8、蛋白酶抑制剂抗虫基因的途径是利用目前已有的植物蛋口酶抑制剂基因序列，比较其同源性，找出保守序列，在此基础上设