转基因植物标记基因安全性研究进展

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1、转基因植物标记基因安全性研究进展随着植物细胞全能性的发现和转基因技术的发展，人类已经利用基因工程改变植物的性状，在提高作物产量、改善品质、解决全球不断增长的粮食需求等方面发挥了重要作用。但随着转基因技术的迅猛发展，在关注转基因植物所带来的巨大经济效益的同时，其安全性问题也日益受到人们的重视。植物转基因操作中，通常用标记基因将转化细胞筛选出来。在选择压力下，非转化细胞不具备抗性而死亡，因此在转基因研究中，抗性标记基因对于从大量非转化细胞中选择转化细胞至关重要。目前，转基因研究中普遍应用的抗性标记基因是抗生素和除草剂抗性基因。这些抗性标记基因在

2、植物转化过程中是很有利的选择工具。然而，一旦转化完成，这些抗性基因便失去了作用，其存在还可能带来生物安全性问题。另外，由于选择标记基因数量有限，这些基因的存在也给转基因植物的再次转化带来了不便。对转基因植物中标记基因的安全性评价主要集中在环境和食品安全性2个方面，其中对环境危害评价已发展到从分子、个体、种群、群落到生态系统的水平。标记基因的环境安全性主要包括：转基因植物的残枝落叶转移到其他土壤微生物中从而导致外源抗性基因的逃逸，可能造成生态失衡；很多情况下标记基因的沉默可能引起邻近目的基因的沉默。转基因产品中的抗生素抗性基因，有可能通过食物

3、链，最终给人类的安全带来潜在的威胁。在解决转基因植物可能存在的安全性问题中，研究者研究了共转化法、转座子法、位点特异性重组系统、同源重组、无选择标记基因的转化系统及安全标记基因的转化系统等方法。现对提高转基因植物标记基因安全性的方法作一综述。1共转化法共转化的原理是将目的基因和标记基因单独组装到2个质粒上，或1个质粒的2个不同T-DNA区段上，然后同时转化。由于T-DNA的插入是随机的，二者可同时插入同一细胞的不同染色体上，经过后代的遗传重组，使目的基因与标记基因分离，从而获得仅带有目的基因的转基因植株（图1）。Komarietaltn构建

4、了包含2个T-DNA的超二元质粒载体，将gus(13-glucuronidase)和hpt(hygromycinphosphotransferase)通过共转化方法转入烟草和水稻，经过后代分离，50%以上的株系为无标记基因的gus转基因植株。Milleretal通过多个菌株共转化玉米，共转化率为11.7%；而通过包含双T-DNA超二元质粒载体进行转化，共转化率高达93.4%。陈松彪等采用体外重组技术构建一个双T-DNA载体系统．41.7%的后代为无选择标记的转基因烟草植株。为了提高共转化效率，研究者们对共转化方法进行了改进。叶兴国等[．q通

5、过几个中间质粒构建了含有3段T-DNA的双元表达载体pNB35SVIP1，高频率获得无选择标记转基因大豆植株。共转化系统去除转基因植物中选择标记为最早研究的技术，因其方法简单，多数无选择标记转基因作物均通过共转化系统所获得。目前，国内外已成功地运用共转化法获得了烟草、水稻、玉米和大豆等作物的无选择标记转基因植株。但是共转化需要有性杂交过程将标记基因和目标基因分离，限制了此种方法在无性繁殖植物中的应用。此外，共转化耗时长，工作量大且转化效率较低，极大地限制了共转化系统的应用。2转座子法转座子是存在于染色体DNA上的一段可自我复制和移动的DNA

6、序列。把标记基因或目的基因和转座子相连，在转座子移动的过程中，标记基因与目的基因分离，子代植株通过遗传分离，获得仅带目的基因的转基因植株。因此，转座子系统可用于培育无选择标记的转基因植株。目前，已经报道的用于转基因植物标记基因删除的转座系统来源于玉米的Ac/Ds系统。Goldsbroughetal以aptⅡ(neomycinphosphotransferaseⅡ)为选择标记基因，以gus为报告基因转化番茄，在转基因植株后代中发现aptⅡ和Ds-gus-Ds结构的重组分离现象，获得了只含gus基因而无选择标记基因aptⅡ的转基因植株。Ebin

7、umaetal将ip￡(isopentenyhransferase)基因插入Ac基因中，然后与aptⅡ和gus基因串联构建成MAT(Muhi-Auto-Transformation)表达载体，用其转化烟草和白杨，在转基因植株后代中发现无标记基因的转基因植株。转座子具有跳跃性和可删除性，不需要再次转化或杂交引入重组酶。但是该途径也存在一些问题，如效率较低、需要有性繁殖分离途径、周期较长等，仅适用于有性繁殖以及生活周期短的植物，限制了其在标记基因剔除中的应用。3位点特异重组系统位点特异性重组系统包括2个基本元件，即重组酶基因和特异性识别位点。把

8、标记基因放在2个识别位点之间，在重组酶的作用下，标记基因可以被切除（图2）。目前，在植物中已发现的有效的位点特异性重组系统有来源于噬菌体P1的Cre/loxP(Cre：cause