基于靶向肽的强化融合蛋白和化学偶联物的制备与抗肿瘤作用研究

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1、中国协和医科大学博士学位论文缩略语A490AEAmpBCABSADMS0EDTAEEDQEUSAESI．MSHPLCHRPLv．ICsoIPrGKanLBLDMLDPMWNGRNGR．LDP缩略语absorbanoBat490rimactiveenextiyneampicillinbicinchoninjcacidbovineSel'Bmalbumindin】ethylsulfoxideethylenediaminetetraacetate2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-6ihydroquinoliaenzymelinked／mmunosorbentassay

2、electrosprayionizationmassspectrometryhigh-performanceliquidchromatographyhorseradishperoxidaseintravenousinjectionconcentrati011of50％inhibitionisopropyl-p-thiogalactopyranosidekanamycinLuria-Bertani(medium)lidamycinlidaproteinmolecularweightAsn-Gly-AIgNGR-lidaproteinfusionprotein490hm波长的吸光度活性型烯二

3、炔发色团氨苄青霉素二羧基二喹啉牛血清白蛋白二甲基亚砜乙二胺四乙酸2一乙氧基-1-乙氧碳酰基一1。2-二氢喹啉酶联免疫吸附分析电喷雾电离质谱高压液相色谱辣根过氧化物酶静脉注射半数抑制浓度异丙基．争D，硫代半乳糖苷卡那霉素LB培养基力达霉素力达霉素辅基蛋白分子量天冬酰胺．甘氨酸一精氨酸NGR肽与LDP融合蛋白中国协和医科大学博士学位论文缩略语NGR．LDP．AEOD6000PDPAGEPBSPCRPVDFr．p．IlLRGDn上IPRrSDSsngrldpTCATLCXgalYNMNGR-lidaprotein—activeenediyneopticaldensityal600hmo-phe

4、nylenediaminepolyacrylamidegelelectrophoresisphosphate—bufferedsalinepolymerasechainreactionpolyvinylidenefluoriderevolutionsperminuteArg—Gly-AsprecombinantlidamyeinapoproteinRoomtemperaturesodiumdodecylsulfategeneofNGR-LDPfusionproteintrichloroaceticacidthinlayerchromatography5-bromo-4-chloro·-3

5、--indolybbeta-D—galactopyranosideyunnanmycin强化的NGR肽与LDP融合蛋白600纳米的光密度邻苯二胺聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应聚偏二氟乙烯每分钟转数精氨酸．甘氨酸．天冬氨酸带有信号肽的重组力达霉素辅基蛋白室温十二烷基磺酸钠NGR—LDP基因三氯醋酸薄层层析5一溴—4．氯一3一吲哚一13-o一半乳糖苷云南霉素中同饥和医科人学博上学位论文中立摘要中文摘要小型化、高效化是靶向抗肿瘤药物的发展趋势，与抗体及其片段相比，靶向肽具有分子量更小、免疫原性更弱的优点。本论文第一部分通过基因工程的方法制备CDl3靶向肽NGR(Asn-GIy-A

6、rg)与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白，再通过分子强化技术组装发色团，得到有活性的强化融合蛋白，并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。第二部分通过化学方法合成抗黏附肽RGD(Arg-Gly-Asp)与云南霉素(yunnanyein,YNM)的偶联物，并研究其抗肿瘤活性。1。CDl3靶向肽与力达霉素强化融合蛋白的制备及抗肿瘤活性NGR-CDl3是良好的肿瘤新生血管靶向系统，NGR序列与肿瘤血管内皮细胞表达的CDl3异构体特异结合。力达霉素(1idamycin．LDM,又叫C1027)是大分子肽类抗肿瘤抗生素，由辅基蛋I；1(1idaprotein,LDP)和活性烯二炔发色团(activeenediy

7、ne，AE)构成，发色团具有很强的细胞毒作用但不稳定，辅基蛋白对发色团起保护作用。LDP和AE以非共价键结合，可以拆分和重建，重建后的蛋白具有同样的细胞毒作用，这为体外LDP融合蛋白与AE的分子重建提供了基础。本研究先通过基因工程的方法制备NGR肽与LDP的融合蛋白，再通过分子强化组装发色团，得到有活性的强化融合蛋白，并对其体内外抗肿瘤活性进彳亍研究。以含Idp基因的质粒pEFL为模板，通过PCR的方法得到含信号肽pcIB、NGR和