制备可控制性大鼠胶质瘤活疫苗的实验研究

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1、博士学位论文制备可控制性大鼠胶质瘤活疫苗的实验研究博士研究生：林健指导教师：徐如祥教授王伟民教授摘要脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤，约占颅内肿瘤40-60％。尽管手术切除、放疗、化疗等常规治疗方法有很大进展，但是胶质瘤病人预后仍然很差，恶性胶质瘤平均生存时间约12～14个月【J】。随着对中枢神经系统和胶质瘤免疫学特性的深入研究和认识，免疫治疗被视为有前景的肿瘤治疗新模式，而治疗性的肿瘤疫苗一直是脑胶质瘤免疫治疗研究的热点12卅。胶质瘤细胞具有免疫原性弱、MHC分子表达低、缺乏共刺激分子和粘附分子表达，并能够

2、产生免疫抑制细胞因子等特性，不仅抑制肿瘤局部免疫细胞抗肿瘤功能，形成有利于肿瘤生长的微环境，甚至影响宿主整个免疫系统，使宿主免疫功能低下等特点，这些均是造成胶质瘤免疫逃避的原因12,81。如何更有效地提高胶质瘤的免疫原性、增强体内和脑内抗肿瘤的特异性免疫活性、以及肿瘤疫苗的安全性，是目前脑胶质瘤疫苗研究中待解决的问题【3,61。利用细胞因子基因修饰肿瘤细胞的疫苗，可以提高肿瘤细胞的免疫原性、增强机体抗肿瘤的免疫反应。细胞因子在瘤苗局部持续表达，可刺激机体产生对抗肿瘤的特异性免疫反应12-“】。脑胶质瘤治疗中已经采用的细胞

3、因子有GM．CSF、IL-2、IL．4、IL-12、INFV、TNFa掣1弘14·lbm。其中IL-12主要由树突状细胞(dendriticcell，DC)、单核／巨噬细胞等抗原提呈细胞(antigenpresentingcells，APCs)产生，主要功能有①促进TN0细胞向THl细胞分化，促进机体的细胞免疫；②促进T细胞成熟、增殖、分泌IFN丫；③促进NK细胞增殖及其杀伤活性；④促进多种黏附分子和MHC分子的表达；⑤抑制瘤体内新生血管形成，从而抑制肿瘤生长；⑥促进NO的生成，致肿瘤细胞凋亡等【l¨”。IL．12被誉为

4、最有效的抗肿瘤细胞因子之一，是连接体内天然免疫和特异性免疫的桥梁[30,31】。肿瘤疫苗的失活是导致其效价降低的主要原因之一。由于缺乏可靠的控制活瘤苗细胞在体内增殖的方法，基于安全的考虑，目前所用瘤苗几乎均采用经放射线照射或抗有丝分裂药物处理灭活【21。研究表明，细胞因子基因修饰的瘤苗，其细胞因子的表达与细胞活性呈线性相关，经放射线处理后的瘤苗与活瘤苗比中文摘要较，细胞因子分泌量显著减∥“”J。人类I型单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexviralthymidinekinase,HSV-TK)基因是当前研究和

5、临床应用最多的一种自杀基因，TK基因转导的胶质瘤细胞对抗病毒药物羟甲基无环鸟苷一更昔洛韦(ganciclovir,GCV)可产生高度敏感性而被杀伤【3删。这种HSV-TK／GCV系统，1993年在我国进行的中国单疱病毒TK基因治疗脑胶质瘤的试验研究中得到进一步证实(国家自然科学基金39370688)。我们于2000年就提出利用TK基因作为可控制因素的“脑胶质瘤活疫苗的实验研究”，已经获得广东省自然科学基金(ooll22)和全军医学科研“十五”计划项目基金(01MA038)的资助。我们设计，将大鼠IL-12基因和TK基因共

6、同修饰胶质瘤9L细胞，并与树突状细胞(Dc)融合，制备DC／9L／rlL-12-TK杂交瘤苗。利用该活瘤苗接种宿主，疫苗接种后一段时间，体内再给予GCV灭活瘤苗，形成既可控制瘤苗体内增殖，又可调控rIL-12分泌的活瘤苗。该疫苗可最大限度地发挥IL-12的抗肿瘤免疫效应，再者，I)C可将胶质瘤细胞共同的相关抗原有效递呈，可以多克隆刺激宿主产生特异性抗胶质瘤免疫反应。本论文的研究内容为该课题中建立基因修饰肿瘤细胞疫苗部分，将为后续的研究作准备。本研究通过构建大鼠rlL-12基因真核表达质粒，先建立dL-12基因修饰的大鼠胶

7、质瘤9L／rlL-12细胞株。再通过构建TK基因慢病毒载体表达质粒和建立TK基因表达的慢病毒包装系统，利用携带TK基因的慢病毒感染9L／rILl2细胞，分步骤制备rlL-12基因和TK基因共同修饰、并稳定表达的大鼠9L／rlL-12．TK胶质瘤细胞疫苗，同时验证了HSV-TK／GCV系统在体外控制9L，rIL．12m【瘤苗细胞增殖的作用。IL-12是由2个不相关的亚基因p40和p35编码的40kD重链和35kD轻链，经二硫键相连而成的异二聚体细胞因子147,48]，在转染哺乳动物细胞时，p40和p35必须同时等量表达才能

8、产生有效的生物学活性的IL_12149,50]。在论文第一章中，我们通过提取Wistar大鼠腹腔巨噬细胞，经脂多糖(LPS)刺激体外培养后再提取细胞总RNA，用RT-PCR方法获取dL-12的p40、p35两个亚基的eDNA。运用分子克隆技术，依次将p40、p35的cDNA插入peDNA3．1(．)／myc-HisA