猪主动脉带瓣导管脱细胞的研究及组织学和生物力学特征

《猪主动脉带瓣导管脱细胞的研究及组织学和生物力学特征》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、博上学位论文第一部分猪主动脉带瓣导管脱细胞的研究及组织学特征摘要背景；心血管组织工程为研究理想的人工心脏瓣膜提供了一种新的方法。组织工程心脏瓣膜的研究目标是生产一种在体循环系统植入后能在体内生长、修复、塑型，具有生命活力及没有免疫反应的心脏瓣膜。支架材料的选择是心血管组织工程研究的重要内容，它为替代的组织提供了一个临时的载体。猪的主动脉瓣的解剖学和组织学特点与人类心脏瓣膜相似，是天然生物源性的支架材料。目前，国内外对天然生物源性的支架研究限于肺动脉带瓣导管或主动脉瓣叶，对主动脉带瓣导管的研究尚未见报道。本实验采用低浓度十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfat

2、e，SDS)脱去猪主动脉带瓣导管的细胞成分及可溶性蛋白，并与Steinhoff的胰蛋白酶脱细胞的方法进行比较。目的是探索一种理想的异种生物基质的脱细胞方法，为组织工程心脏瓣膜的研究提供一种良好的天然生物源性的支架材料。方法：(1)猪主动脉带瓣导管的获取及分组：猪主动脉带瓣导管来源于本地屠宰场。将猪心脏连同二尖瓣前叶及上方2．0cm左右的主动脉完整切下，以冰保存，2小时内送回实验室进行修剪。剔除周围脂肪组织及瓣环周围肌肉。用含抑肽酶(10KIU／m1)，EDTA(0．1％，w／v)，青霉素(100Ll／m1)，链霉素(100ktg／m1)的无菌PBS溶液充分清洗，储存于4。

3、C新鲜的PBS液中，分组处理。A组：新鲜对照组；B组：O．I％SDS脱博上学位论文中立摘要细胞组；C组：O．05％胰蛋白酶．0．02％EDTA脱细胞组。(2)猪主动脉带瓣导管的脱细胞处理：B组：猪主动脉瓣置于低渗Tris—HCI缓冲液(O．01M，pH8．O)含O．1％EDTA(w／v)和抑肽酶(10KIO／m1)溶液中，4"C静置14h。转入13．1％sDs(w／v)等渗Tfis-HCI(o．05M，pH8．o)溶液中24h；PBS溶液清洗；转入DNase200／[19／ml、RNase20”g／111l等渗Tris．HCl液中(o．05M，pH7．6)4h；PBS溶液

4、洗涤。上述溶液均含EDTA(O．1％，w／v)幂n抑肽酶(10KIU／m1)。所有步骤均在37"C恒温，持续震荡下进行。C组：猪主动脉瓣置于O．05％胰蛋白酶．0。02％EDTA的PBS溶液中24h；PBS溶液清洗；转入DNase200／29／ml、RNase20／比g／mlPBS溶液中4h；PBS溶液洗涤。所有步骤均在37"C恒温，持续震荡下进行。(3)试片检测：分别取主动脉壁和瓣叶进行检测。HE染色作组织学观察；Ⅷ因子、a．actin分别检测内皮细胞和平滑肌细胞；I型胶原染色观察胶原分布；扫描电镜(SEM)观察超微结构；检测组织中可溶性蛋白及I型胶原蛋白含量。结果：(

5、1)瓣叶基质的脱细胞：B组彻底脱去了瓣叶中的细胞成分，基质中留下不连续的空洞，没有细胞及细胞碎片残留。免疫组化染色显示胶原纤维完整，排列紧密。c组瓣叶中的内皮细胞和间质细胞基本脱去，I型胶原染色胶原纤维排列疏松，可见纤维断裂。(2)主动脉壁脱细胞效果：HE染色显示B组主动脉壁的内皮细胞和间质细胞基本脱干净，Ⅷ因子及a．actin检测无细胞存留。HE染色显示C组主动脉壁博士学位论文中文摘要的内皮细胞及内皮下层的问质细胞也已基本去掉，但中膜层仍有较多间质细胞，Ⅷ因子检测阴性，中膜层a—actin检测阳性。(3)电镜观察：SEM显示：B组主动脉壁和瓣叶表面内皮细胞几乎完全脱落，

6、胶原纤维排列紧密，结构清晰，未见明显纤维断裂。C组主动脉壁和瓣叶表面内皮细胞脱落不完全，呈局灶性脱落，胶原纤维排列紧密，可见部分纤维断裂。(4)组织生化含量测定：两种脱细胞方法使瓣叶中的可溶性蛋白含量(B组为35．83±3。07pg／mg干重瓣叶：C组为27。68±9。07Ⅱg／mg干重瓣叶)均明显少于对照组(58．88±7．89lag／mg干重瓣叶)(P<0．01)；两种脱细胞方法使管壁中的可溶性蛋白含量(B组为15．91_4-4．30ug／mg干重管壁；c组为19．944-8．37Hg／mg干重管壁)均明显少于对照组(34．52±4．28ug／mg干重管壁)(P<0．

7、01)两种方法之间比较无明显差异(B与C比较，P>0．05)。两种脱细胞方法均未减少瓣膜和主动脉壁中I型胶原蛋白的含量(与对照组比较，P>0．05)；两组方法之间比较也无差异(B与C比较，P>0．05)。结论：(1)SDS方案能几乎完全脱去猪主动脉带瓣导管中的细胞成分，而细胞外基质结构得到了很好保存。(2)o。05％胰蛋白酶．0．02％EDTA也能部分脱去猪主动脉带瓣导管中的细胞成分，但对主动脉壁的效果差，且对细胞外基质结构有破坏作用。关键词：组织工程，支架，脱细胞，十二烷基硫酸钠，胰蛋白酶博l=学位论文中史摘要第二部分脱细胞