勃利霉素对马铃薯晚疫苏氨酰trna合成酶的作用

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1、摘要曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼蔓曼曼!蔓曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼舅曼曼!舅曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼曼量摘要勃列霉素(Borrelidin)是由链霉菌(Streptomy，cesrochei)发酵产生的十八元环大环内酯类抗生素，其结构中包含一个氰基，在自然界中较为罕见。Borrelidin具有抗癌活性、抗血管生成活性、抗疟疾活性和抗菌活性，Borrelidin通过特异性抑制苏氨酰．tRNA合成酶(ThrRS)的活性来发挥生物活性作用。Borrelidin与ThrRS的作用机制尚不明确，还需

2、进一步研究。本研究利用Borrelidin对马铃薯晚疫霉菌在体外的抑制作用，得到其对马铃薯晚疫的Ic50。根据苏氨酸(Thr)补偿，观察得到Borrelidin对马铃薯晚疫霉菌抑制作用减弱结果。通过设计含有NdeI和HindlII酶切位点的引物扩增马铃薯晚度的ThrRS序列，研究其在大肠杆菌系统中表达情况，并进行了Borrelidin对马铃薯晚疫ThrRS的体外酶活性功能测定，主要研究结果如下：(1)通过体外生理测试，得到Borrelidin对马铃薯晚疫的IC50值为0．0528gg／ml。(2)使用盐析法提取马铃薯晚疫基因组，根据马铃薯晚疫

3、ThrRS基因序列保守区域设计含有酶切位点的引物，克隆ThrRS序列，将所得到的基因序列进行测序，并在NCBI上进行序列比对。比对结果显示，克隆序列与马铃薯晚疫T-130菌株ThrRS序列同源性高达100％，证明该克隆片段为马铃薯晚疫苏氨酰一tRNA合成酶基因。(3)将本研究中克隆得到的苏氨酰。tRNA合成酶基因连接到用NdeI和HindIII酶切处理过的原核表达载体pET-32a(+)上，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以融合形式进行蛋白表达。对诱导剂浓度、诱导温度、摇床转速及时间进行了探索，获得了最佳表达条件，当IPTG终浓度为0．

4、5mM，摇床转速在160rpm，16℃，培养16h时，目的蛋白表达量最高。经SDS-PAGE分析表明，在83．8KDa附近获得了预期的表达条带。使用镍琼脂糖凝胶柱纯化，在透析液中进行24h透析，最终纯化蛋白浓度可达：2．23mg／mL。(4)纯化得到的蛋白与ATP和Thr进行反应，通过液相色谱分析Thr减少量测蛋白酶活，分析Borrelidin与纯化蛋白、ATP和Thr的反应，通过液相色谱检测Thr量的变化，测出Borrelidin对马铃薯晚疫苏氨酰．tRNA合成酶的抑制作用。综上所述，本文研究通过Borrelidin对马铃薯晚疫的抑制，为探

5、索新型生物农药的方向提供理论依据，并为Borrelidin与ThrRS的作用机制的研究提供信息。关键词Borrelidin；马铃薯晚疫；苏氨酰一tRNA合成酶；苏氨酸Abstract曼曼舅曼曼曼曼詈量曼曼曼曼曼曼曼曼蔓曼曼曼曼蔓曼量曼曼曼曼曼皇曼曼曼舅皇曼曼曼曼曼曼曼!曼曼詈!曼曼曼量曼曼曼曼曼尝III曼曼曼鼍舅!曼TheActionofBorrelidin．InhibittoPhytophthorainfestansThreonyl--tRNASynthetaseBorrelidinis18-memberedringmacrolideant

6、ibioticproducedbyfermentationofStreptomycesrochei．Itsstructureincludesanovelnitrile．whichiSuniqueandrareinnature．Borrelidinispossessedofanticanceractivity,antiangiogenicactivity,antimalarialactivityandantimicrobialactivity,whichplayarolebyspecificallyinhibiting；theactivityo

7、fthethreonyl-tRNAsynthetase(TⅫ媳)．HoweverthemechanismofthereactionbetweenBorrelidinandThrRSisstillunclearandfurtherresearchisrequired．ThisstudygetstheIC50ofborrelidintoPhytophthorainfestans∽infestans)byinvitroinhibitionofborrelidinon脚tophthorainfestans∽infestans)．Weobserveth

8、atcompensationofthethreonine(Thr)weakentheinhibitionofborrelidinon户螈’stans．Westudy