草莓pldα+cdna克隆及其反义基因遗传转化的研究

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1、新疆农业大学硕士学位论文草莓PLDαcDNA克隆及其反义基因遗传转化的研究姓名：卢秀丽申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：罗淑萍;袁海英20090601草莓皿D仪eDNA克隆及其反义基因遗传转化的研究摘要草莓(Fragariat2tlal'tO$SQDueh．)是～种多年生草本植物，在世界许多国家都有分布。它的果实是典型的非跃变型果实，采收后极易腐烂变质，不耐贮藏，在这一过程中细胞壁及细胞膜结构的降解代谢起了促进作用。因此，在果实成熟衰老过程中保持细胞膜结构和细胞区域化结构的完整性具有重要作用。磷脂酶Da(PLDa)与草莓果实的成熟有关，其活性的增加是细胞膜衰老时受损的第一

2、步，因而有效控制PLDa的活性有助于研究PLDa基因对草莓果实耐贮性的影响。本研究采用PlantRNAReagentKit从达赛莱克特(Darseleet)草莓完熟果实中提取出纯度较高、完整较好的总RNA，利用RT-PCR技术扩增得到PLDa基因的HKD2功能区基因序列，将其T-A克隆至pMDl9．Tsimpleveetor上，测序正确后克隆载体经双酶切消化，目的片断反向插入到植物表达载体pBll21中，构建草莓PLDa基因的反义植物表达载体pBll21．PLD。通过冻融法将携带反义eDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404，并对草莓进行遗传转化研究，以期获得该基因表达的缺陷型

3、植株，进而确定其在草莓果实成熟衰老中的调控作用。在实验过程中同时构建草莓PLDa基因正义植物表达载体pBll21．PLD，并对其进行了遗传转化，目的是在后续的果实耐贮实验中对两者进行比较。在农杆菌介导的遗传转化体系中，将培养至对数生长期的农杆菌，用无激素的液体MS培养基稀释成OD6∞值为0．3"-0．6的侵染液，侵染已预培养3d的草莓叶盘10min，共培养3d，用液体MS培养基冲洗叶片，滤纸吸干后转到含Cef300mg·LJ分化培养基上培养7～10d，再转到Cef300mg·L～、Krn20rag·L‘1的选择培养基上筛选培养。经Km选择压初步筛选出6棵转基因草莓植株。对获得的抗性植株进行P

4、CR扩增和Southernblotting杂交分析，有4株为阳性，说明目的基因已整合到草莓基因组中。关键词：草莓；PLDa基因；反义植物表达载体；遗传转化；Southem杂交CloningofPLDaeDNAinStrawberryandStudiesofAntisenseGeneGeneticTransformationAbstractStrawberry(FragariaaTqa，：lassaDuch)isakindofperennialherb，whichwascultivatedwidelyintheworld．Strawberryfruitisatypicalnon-elimate

5、ricfruitandgetrotteneasilyafterpicked，whichwasacceleratedbythecatabolicbreakdownofcellularstructuresuchasthecellwallandthecytomembrane．Thereforekeepingintegrityofmembranestructureandcompartmentalizationplaysallimportantroleintheprocessofripening．PLDaisrelatedtomaturityofstrawberryfruitandincreasing

6、activityofPLDaisthefirststeptodamagemembraneincellsenescence．EffectivelycontrolledtheactivityofPLDawillconducedtostudytheeffectofPLDageneonstorageperiod．TotalRNAwasextractedfromthematurefruitofDarselectstrawberrybyPlantRNAReagentKit,thenHKD2domaingeneorderwasamplifiedbyreversetranscdptasepolymerase

7、chainreaction(R二PCR)andclonedintopMDl9一Tsimplevector．Thepositiveclonesweresenttosequence．AfterconfirmingitsvaliditycloningvectorWasdigestedwithdoubledigestion,thePLDagenefragmentwasinvertedinverselyintoplan