反义磷脂酶DγPLDγ基因转化草莓的研究

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1、山东农业大学硕士学位论文反义磷脂酶D<,γ>(PLD<,γ>)基因转化草莓的研究姓名：闫华晓申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：崔德才2003.6.1关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究艨取得的成果。对在论文磷究期闫给予指导、帮动帮做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按嚣求向国家有关部门或机构送交论文纸质本联电子敝，允许论文被查阕和借阕。本入授权融东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索

2、，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：监刻普筛签名：Z蕴蟛西潮：亟熟“，山东农业大学硕士学位论文中文摘要草莓(FragariagnangssgDuch．)是一种经济价值较高的小浆果，为一种多年生草本植物。因为成熟期比较集中，储存期较短，所以限制了其运输和大规模生产。本研究课题以草莓为实验材料，以其叶片为外植体，系统地研究了激素浓度、叶片生理状态、光照条件等诸多因素对不定芽再生的影响，建立了草莓叶片培养诱导不定芽高频再生的体系。在此基础上，用携带反义磷脂酶D，基因(PLD，)的根癌农杆菌介导转化草莓叶片，通过对转化方法

3、和转化条件的探索，建立了草莓的遗传转化体系。草莓遗传转化体系的建立对利用基因工程对草莓进行品种改良起着重要的作用。／研究结果表明不同基因型、叶龄、暗培养、基本培养基、不同激素组t合、Ag+等诸多因素对叶片再生有显著的影响，建立了不依赖于TDZ的弗吉尼亚草莓叶片外植体的不定芽再生体系。研究结果表明Af并不能促进草莓弗吉尼亚植株的再生，反而起到了抑制作用。以顶部充分伸展的18—2l天叶龄的无菌苗叶片为外植体，再生效果最好，在叶片远轴面上划几刀，造成伤口，以该面接触培养基，接种在以淞为基本培养基、附加6一BA1．6一1．8mg／L．6-BA0．1mg／LNAA，KT0．4-0．5mg／L

4、，和2，4一D0．1mg／L的分化培养基上诱导芽分化，14天后分化出不定芽，不定芽出现的高峰期在接种后的20一30天。通常不定芽散布在叶片的各个部位，以切口部位较多，芽分化率高达60％以上。该再生体系可作为基因转化的受体系统。在建立了草莓叶片培养诱导芽高频再生体系的基础上，建立并优化了农杆菌介导的草莓遗传转化体系。具体过程是：将培养至对数生长期的农杆菌(OD。so-O．5)用等体积的5％的蔗糖溶液(含一定浓度的表面活性剂)稀释成侵染液，侵染叶片10分钟，将侵染之后的叶片置于含上述蔗糖溶液的闫华晓：反义磷脂酶D。(PLD．)基因转化草莓的研究培养皿中，共培养3天。用无菌蒸馏水冲洗叶片

5、3次，滤纸吸干后接种于含300mg／LCef的分化培养基上，恢复培养7天。最后转到选择培养基上(MS+I．6一1．8mg／L6一BA+O．1mg／LNAA+O．4-0．5mg／LKT+O．1mg／L2．4-D+300mg／LCef+20mg／LKan)培养，筛选抗性苗。少／对抗性植株进行PCR检测和PCR—Southern杂交检测，结果表明反义PL／)。基因己整合到植物基因组中。关键词：草莓、叶片培养反义磷脂酶D，基因．根癌农杆菌遗传转～，、——．——些垄坐些查兰堡主鲎堡垒塞StudiesonTransformationofAnti-PhospholipaseD。(anti-PLD

6、r)GeneintoStrawberry(FragariaXananassaDuch．)ABSTRACTStrawberry(FragariaananassaDuch．)isakindofsmall，perennialberrywithhigheconomicworth．Becausethematureperiodisconcentrate，itsconveyancewiththelarge—scaleproductionarelimited．Theleavesofstrawberrywereusedasthematerialandseveralfactorssuchashormo

7、neconcentration，physiologicalconditionsofexp】ant,illuminationofculture，andSOonwereinvestigatedtooptimizetheregenerationsysteminvitro．Ahighfrequencyregenerationsysteminculturehasbeenetablished．ThisculturesystemwasadaptedtoAgrobacerium—me