玉米转化酶抑制子cDNA的克隆及功能研究

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1、摘要玉米不仅是重要的粮食和饲料作物，同时也是重要的工业原料，提高其产量在农业和工业领域均有重要意义。淀粉是玉米的主要贮存物质，因此提高玉米的淀粉含量一直是人们的研究热点．随着分子生物学技术的发展，利用基因工程方法提高玉米淀粉含量，改善玉米品质为人们提供了极大的便利。基因工程技术突破了原来传统常规育种的一些限制，使将外源特异基因引入植物成为可能，解决了远源不亲和的限制：或是特异地干扰植物自身的一些基因，以便于研究某个基因或某个基因家族的具体功能。本研究利用RNA干扰技术，抑制与淀粉合成相关的转化酶抑制子基因表

2、达，提高玉米内源转化酶活性，进而增强分解蔗糖的能力，为淀粉合成或其他器官建成以及营养物质的合成提供充足的原料。本文研究重点放在淀粉上，主要结果如下：取自交系综3l授粉后4—7天的玉米籽粒，提取总RNA，利用RT-PCR方法克隆转化酶抑制子全长eDNA(n州)，将其正反义片段构建在植物表达载体p3301上，使其能特异的干扰玉米内源INH。将构建好的RNA干扰载体转入农杆菌LBA4404中，利用农杆菌浸染法转化玉米幼胚。共浸染综3l幼胚约2500个，经4轮PPT(除草剂)加压筛选后获得约150块抗性愈伤，最后获

3、得约200株转基因苗，成活120株。PCR检测成阳性的有45株。通过对转基因玉米Tl代PCR检测、RT-PCR分析干扰效果、酶活分析、糖份及淀粉含量测定得到如下结果：转基冈株系刀V日基因的表达较野生型均有不同程度的降低，不同株系干扰效果不同；转基因株系的两种转化酶{与细胞壁结合的转化酶(CWl)和液泡转化酶(SAI))活性与野生型比较均有不同程度的提高，其中CWI活性最高为野生型的2．5倍；SAI活性最高为野生型的2．3倍。转基因株系的葡萄糖、果糖以及蔗糖含量与野生型比较均有上升，其中葡萄糖含量最高为野生型

4、的1．9倍；果糖含量最高是野生型的2．4倍；蔗糖含量最高是野生型的1．7倍。转基冈株系的淀粉含量也比野生型有所上升，最高含量是野生型的3倍。关键词：转基因玉米，淀粉含量，转化酶抑制子，RNA干扰AbstractMaizeisoneofthemostimportantcropsintheworldduetoitsvarioususageinfood,feedandindustry．Starchasthemainmaizestoragematterisalsoakeydeterminantofprocessin

5、g,cookingandediblequalities．Thereforeincreasingstarchcontentorimprovingitspropertiesistheimportantgoalsofmaizebreeding．Alongwiththedevelopmentofmolecularbiologyandgeneengineering,especiallytheRNAiinterferenceandtransgenictechnologies,itbecomespossibletopur

6、posefullymanipulatestarchsynthesis．Inthisexperiment,invertaseinhibitorrelatedtomaizestarchsynthesisWasknockedoutbyusingRNAinterferencetechnologyinordertoincreaseinvertaseactivityinmaize．ThedetailedworkWasasfollows：full-lengtheDNAcloneofmaizeinvertaseinhibi

7、torWasisolatedfrommaizeinbredZong31immatureseeds4-7daysafterpollinationbyusingRT-PCR．AntisenseinhibitorgeneWasconstructedontothevectorp3301andintroducedintomaizeinbredzong31viaAgrobacteriumtumefaciens-mediatedmethod．Totally2500immatureembryosisolated17-18d

8、aysafterself-pollinationwereinfected．Throughfourtimes’PPT-resistantselections．150resistantealliwereobtained，and200plantletsweregenerated，andfinally45oneswerePCRpositive．TheINHexpressionlevelintransgeniclyplan