胞雄激素非依赖转变过程中的表达变化

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1、论文题目：堡iB盥△苎在苴到膣疸L盥￡垒￡细胞雄邀塞韭筮戆整銮过猩主数麦鲨銮丝答辩委员会主席：耋迭贺数援答辩委员会成员：昌建堑数援王咽山数拯目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．26分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36，J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44个人信息⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．52综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．64温卅I医学院硕士学位论文miRNAs在前列腺癌LNCaP细胞雄激素非依赖转变过程中的表达变化中

3、文摘要目的l、构建激素依赖性前列腺癌和激素非依赖性前列腺癌的miRNAs表达谱。2、找出与前列腺癌雄激素非依赖性转变过程相关的miRNAs。方法l、本实验以雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞为实验的对照组，长期培养在加有氟他胺的无雄激素环境中培养的雄激素非依赖性LNCaP细胞即舭一LNCaP为实验组，两组细胞于37℃，5％C02培养箱中培养，平均三天换培养液一次，六天传代一次。2、实验组和对照组细胞平行传代后的第四天，(此时两组细胞处于对数生长期，培养瓶底达80％覆盖率)，收集细胞。3、采用Ambion公司提供的mirYanaTMPARISKit提取实验组和对照组细胞总RNA，此过程严

4、格按照试剂盒说明书进行。4、取实验组和对照组总RNA各1pl，用DEPC水稀释后70。变性2分钟，上Agilent2100对样品的纯度和浓度进行检测。5、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离小片段RNA，割胶分离，对小分子RNA进行绝对定量后用solexa高通量测序仪对实验组和对照组的小片段RNA(<40nt)进行测序。6、solexa测序所得出的数据与人基因组序列进行比对分析。7、将测序所得出的sRNA序列信息和miRNA文库比对分析，筛选出两组细胞表达的miRNAs。8、对solexa测序得出的miRNAs原始数据进行分析，筛选出实验组和对照组之间差异表达的miRNAs。9、实时荧光定量PCR对

5、筛选出差异表达的miRNAs进行验证。结果1、平行传代后第五天将实验组和对照组细胞子倒置显微镜观察，发现细胞贴壁生长良好，折光性好，细胞瓶底覆盖率达70．80％，处于对数生长期，可以用于试验。2、Agilent2100对所提取总RNA进行检测结果显示：实验组细胞总RNA的RIN值为9．8，28s：18s--2．1，对照组细胞RIN值为9．4，28s：18s=1．9，所提取温州医学院硕士学位论文实验组和对照组细胞的总RNA未发生降解，其完整性、纯度及总量均符合solexa样品制备要求。3、Solexa测序的结果显示实验组细胞内长度为22nt的小分子RNA占所有测序结果的41．88％，测序

6、无杂峰干扰的小分子RNA序列占68．83％；对照组细胞内长度为22nt的小分子RNA占所有测序结果的42．10％，测序无杂峰干扰的小分子RNA序列占74．57％。4、Solexa测序所得的原始数据与人基因组序列进行比对分析，结果显示测序结果与基因组序列有良好的符合率。实验组测序的结果分析显示全长sRNA序列与基因组序列的符合是74．25％，每条sRNA序列的表达量与基因组序列的符合率是93．63％；对照组细胞测序结果分析显示全长sRNA序列与基因组序列的符合是62％，每条sRNA序列的表达量与基因组序列的符合率是94．18％。两组细胞间公共序列分析结果显示：两组间共同表达的小分子RNA

7、占所测出的小分子RNA的88．90％，；实验组细胞表达而对照组细胞不表达的小分子RNA占所测出的小分子RNA7．50％；对照组细胞表达而实验组细胞不表达的小分子RNA占所测出的小分子RNA3．60％。5、sRNA与miRBase的比对结果显示：实验组细胞检测出miRNA共376个，对照组细胞检测出miRNA共357个。6、以差异倍数≥2．0和p≤O．001为标准筛选出实验组细胞和对照组细胞之间差异表达的miRNAs共94个，其中48个表达上调，