幽门螺杆菌ureb基因及其片段的表达和免疫研究

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1、906661中图分类号：Q943．1密级：公开⑩膨炉z角矢乎硕士学位论文论文题目：幽f]爨拄菌垡趟基国盈甚兰段的麦达麴袅疫班究提交日期：二oo六年一月幽门螺杆菌ureB基因及其片段的表达和免疫研究摘要幽门螺杆医j(Helicobacterpylori，Hp)是一科t革兰氏阴性菌、呈螺旋形，足引起人发生慢性活动性胃炎、胃和十二指肠溃疡的主要病原菌，同时与胃腺癌、胃粘膜柏关淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生也密切相关。临床现有的根除Hp的手段主要是联合应用抗生素，但由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、较高的花费以及病人

2、的低依从性等，限制了抗菌药物的疗效，因此，迫切需要进行免疫防治研究工作。幽门螺杆菌尿素酶是一种高亲和力、高活性和高分子质量的蛋白质。纯化尿素酶是山尿素酶A亚单位和B亚单位组成。尿素酶具有保护力、免疫原性、表面暴露和高度保守性，是幽门螺杆菌的主要抗原成分，尤其是尿素酶B亚单位(UreB)，已经被证明可以刺激机体产生免疫应答且具有较好的免疫保护性。但是，由于UreB分子较大，在大肠杆菌中不易重组表达，而且UreB的重组表达产物多为包含体形式，表达蛋白失去活性而且提取工艺复杂。凶此，我们以本实验室构建的具有分泌表达系统的大肠

3、杆菌基冈工程菌，即转入ureB及其P、厂、m三个不同片段的大肠杆菌为研究对象，分析不同重组蛋白(rUreB、E、F、M)的表达和免疫性质。l、借助生物信息学技术对重组蛋白理化性质、二级、三级结构等进行预测、分析，为实验结果的分析提供依据2、用SDS—PAGE分析重组蛋白的表达情况，实验结果表明ureB基凶及其小片段在大肠杆菌巾均有特异性表达；用Western．blot检测其抗原性，结果说明蘑组蛋白都具有一定抗原性；表达形式鉴定结果为rUreB主要存在于包含体中，F在包含体、周质和细胞质组分r}，都仃一定的蛋白积累，而M

4、和E主要存在于周质r{，；对表达条件进行Tgt化，结果为在对数中期加酸调节PH为5．5、继续培养至12h时表达量最高。3、将基凼jI：程菌表达产物结合免疫佐剂皮下多点注射免疫BALB／C小鼠，免疫四次，每次问隔7火，采集血清J1jELISA法检测各组小鼠血清中IgG和IgA水平，比较不同免疫原产生的免疫应答情况。BALB／c小鼠经重组蛋白免疫后产生了具有显著性的免疫应答(P<0．01)，不同重组蛋白小鼠免疫组血清lgG水平强到弱依次为：M>E>rUreB>F，小鼠血清IgA水平由强到弱依次为：E>F>rUreB>M。4

5、、免疫实验结束后用幽门螺杆菌ssl对小鼠进行攻击，38天后用快速尿素酶试验、涂片实验和Giemsa染色对H口在动物胃内的定植及生长情况进行评价，用HE染色对Hp攻毒实验后小鼠胃组织的病理情况进行评价，探讨重组蛋白对Hp感染的免疫保护作用。结果表明小鼠经Hp攻毒实验后胃组织全部有HP定植，重组蛋白免疫组都具有一定保护作用，刁i仅能使免疫小鼠Hp感染数目减少，而且能减轻胃粘膜慢性炎症反应。rUreB、F、M、E的保护率依次为50％、40％、70％、50％。本研究结果说明：ureB及其不同片段可在本实验室构建的人肠杆菌分泌表

6、达系统中获得表达。m、g片段获得可溶性表达产物。重组蛋[J免疫后可引起小鼠产生较强免疫应答。重组蛋白免疫组小鼠对幽门螺杆菌攻击具有免疫保护作用，M免疫组保护作用最强。关键刊：幽门螺杆菌，ureB，』I段，表达，免疫STUDIES0NEXPRESSIONANDIMn仉，NITY0FHELICOBACTERPYLoIUureBGENEANDITSFRAGMENTSABSTRACTHelicobacterpylori(Hp)，agram—negativespiralbacterium，isthemajoretiologica

7、lfactorofchronicactivegastisisandmostpepticulcerdisease，andiscloselyassociatedwithgastriccancertumorssuchasadenocarcinomaandMALTlymphoma．CurrenttherapiesforeradicatingHpdependontheuseofcombinedantibiotics．Howeverthehighcost，lowpatientcompliance，andincreasingofre

8、sistantstrainsmakethesetherapiesimpracticalonalargescale．Therefore，thereisanurgentneedforeffectivevaccinesagainstHPinfectionHpureaseisonekindofhighaffinity,highactive