精氨酸修饰的壳聚糖非病毒基因载体的研究

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1、中文摘要壳聚糖是～种天然的阳离子多糖，具有良好的生物相容性，生物降解性，低免疫原性以及无毒性的优点。壳聚糖通过静电作用可以与DNA形成聚电解质复合物，保护DNA免受核酸酶的降解，从而促使DNA顺利的进入细胞，因此壳聚糖作为非病毒基因载体具有广泛的应用前景。本文制备了一种新型的精氨酸修饰的壳聚糖(Arg．cs)非病毒基因载体，研究内容主要包括以下两个方面：1、精氨酸修饰的壳聚糖的制备及其与DNA复合物的表征。以碳二亚胺为偶联剂，将精氨酸偶联到壳聚糖上制备了精氨酸修饰的壳聚糖缀合物，并通过复凝聚的方法，制备了纳米尺寸的Arg—CS／DNA聚电解质复合物。通过红外光谱

2、和核磁共振图谱分析，可以确认精氨酸已经共价连接到壳聚糖上。圆二色谱结果表明DNA与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复合物后仍然保持着典型的B型构象。用透射电镜，原子力显微镜和光子相关光谱检测复合物的表面形态和尺寸大小分布，结果表明，精氨酸修饰的壳聚糖／DNA纳米复合物叫／P=2：1)呈现不规则的球形，复合物的直径分布大多在80～150nm之间，有利于基因转染。2、细胞系和组织块法培养血管平滑肌细胞，并以血管平滑肌细胞为宿主细胞，初步探讨以精氨酸修饰的壳聚糖为载体，介导编码绿色荧光蛋白质粒转染的可行性。倒置荧光显微镜下观察到明亮清晰的绿色荧光，并且呈现出明显的平滑肌细胞形

3、态，说明编码绿色荧光蛋白的质粒DNA被精氨酸修饰的壳聚糖载体成功地导入血管平滑肌细胞，并得到有效的表达。关键词：壳聚糖，精氨酸修饰的壳聚糖，非病毒载体，基因转染AbstractChitosanisanaturallyoccurringcationicpolysaccharidewithgoodbiocompatibility,biodegradation，lowimmunogenicityandnon—cytotoxicity．Chitosanisconsideredtobeagoodcandidatefornon—viralvector，sincecation

4、icallychargedchitosanCarlefficientlycondensenegativelychargedDNAtOformpolyelectrolytecomplexesviaelectrostaticinteraction，facilitatingthetransportoftherapeuticgenesacrosstheeellmembrane．Inthisthesis，anovelarginine—modifiedchitosan(Arg—CS)non—viralvectorwasdeveloped．Theworkmainlyfocus

5、OilthefollowingtWOparts：1SynthesisofArg—CSandcharacteristicsofArg·CS／DNApolyelectrolytecomplexes．ChitosanWaSmodifiedwithargininebyusingI-ethyl一3一(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)andN-hydroxysuccinimide(NHS)ascouplingagents．Arg-CS／DNAcomplexeswerepreparedbycoacervationprocess．T

6、heformationofArg—CSandthepropertiesofAN-cs／DNAcomplexeswereinvestigated．FTIRand1。CNMRspectraresultsshowedthatargininewaschemicallycoupledtochitosantOformarginine-modifiedchitosanconjugates．CDspectraindicatedthattheinteractionofDNAwithchitosanmerelycausedasli曲tperturbationofDNAbondsan

7、dDNAstillremainedB—conformationwithinthecomplexesTEM，AFMandDLSresultsrevealedthatthecomplexeswerenearlysphereswithmeandiameterabout80一l50rim，whichiSverysuitableforgenedelivery．2．Cellcultureofvascularsmoothmusclecell(VSMC)byceillineandtissueculture．TakingVSMCashostcell，thepreliminaryc

8、elltransfect