新型壳聚糖精氨酸衍生物基因载体的构建及其基因传递效率的研究

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1、一Ｔ儀Ｗ义々ＯＣＥＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＣＨＩＮＡ硕±学位论文ＭＡＳＴＥＲＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ新型壳巧巧精氨酸衍生物基因載体的论文巧目：构建及其基因传递效率的研究Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ＇ｅｆｉｃ－ｉｅｎｃｙｓｔｕｄｙｏｆａｎｏｖｅｌａ巧ｉｎｉｎｅｃｈｉｔｏｓａｎ英文题目：ｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｓｓ化ｍｙ作者：褚天娇巧导教师：常菁剝巧学位类别：全曰制专业硕±生物工程专业名称：研巧方向：基因工程Ｉ－打

2、咕可．Ｉ＾，．屬Ｌ—１谨＞１１＾此论文献给我的导师常菁实验室所有的老师和同学我的父母和亲人褚天娇新型壳聚糖精氨酸衍生物基因載体的构建及其基因传递效率的硏究学位论文答辩口期：Ｗ－指巧教师签字：＾＾答辩委员会成员签字：了！幕Ｚ独御声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研巧工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研巧成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均己在论

3、文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名签字日期■；的年Ｔ月曰，５学位论文版枚使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意１＾下事项：１、学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。２、学校可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印＂、缩印或妇描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学中＂国学术期刊（光盘版）电子杂志社用于出版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研巧所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保密的学位论文

4、在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：＇签字日期言月？：的｜５年＾日签字日期？年ｆ月曰新型壳聚糖精氨酸衍生物基因載体的构建及其基因传递效率的硏究摘要壳聚糖及其衍生物具有良好的生物相容性、生物降解性及优越的复合压缩ＤＮＡ的能力，在基因载体领域中被广泛关注。但壳聚糖较差的溶解性及其较低的基因转染效率在很大程度上限制了其深入开发和应用。如何提髙其基因传递效率一，直是研巧者们亟待解决的难题。本研巧利用精気酸及聚精氨酸对壳聚糖进行了改性，制备了（聚）精気酸改性的壳聚糖，继而将其与质粒复合构建了复合纳米粒子，对纳米粒子的理化特征和基因传递效

5、率进行了系统研究与分析。首先一，壳聚糖为原料与精氨酸及五狀精氨酸按定配比进行反应，得到精ｉ－－氨酸壳聚糖和五狀精巧酸壳聚糖产物。所得产物采用ＨＮＭＲ核磁对其化学结控进狂塞征。然后，将两种产物通过静电作用和质粒复合，形成稳定的复合粒子，对复合粒子的形貌特征、Ｚｅｔａ电位、缓冲能力妊巧研巧和分析，并通过凝胶阻滞实验研巧其复合能力及ＤＮａｓｅＩ保护能力。最后，按不同的Ｎ／Ｐ比构建复合粒子，－２９３人使用ＨＥＫ胚肾上皮细胞对复合粒子的细胞毒性进行研究，并对其入胞效率、入胞途径及体外基因传递效率进行了系统研究与分析。实验结果表明－－，成功制得壳聚糖的衍生物ＣＳＡｒ

6、和ＣＳ５Ａｒｇｇ，其取代度分别为６．４５％和４．９０％．０ｋ３ｋ。，分子量分别为２１和２．８改性后的壳聚糖具有良好的ＤＮＡ复合和压缩能力，均可Ｌッ同ＤＮＡ形成稳定的复合粒子，复合粒子直径－８ｎｍ。在１００ｎｍ左右，平均髙度在６，形态分布较均匀，符合纳米粒子的特性改性后壳聚糖的缓冲能力较壳聚糖有明显提髙，其中精氨酸修饰后的壳聚糖缓冲能力为壳聚糖的四倍，五狀精氨酸修饰后的壳聚糖缓冲能力为壳聚糖的两倍。电位测定结果思示经（聚）精氨酸修饰的壳聚糖电荷分布在＋２１至＋３１ｍＶ范围内，具有较理想的结合带负电的质粒的电位电势值－。凝胶阻滞实验结果表明，ＣＳＡｒ、

7、ｇＣＳ－５Ａｒ分别在Ｎ／Ｐ比８与６时可与质粒完全复合。ｇ，具有良好的质粒包覆作用－ＤＮａｓｅ１保护实验表明ＤＮＡ－，ＣＳＡ巧／ｐ、ＣＳ５Ａｒｇ／ｐＤＮＡ复合粒子在１Ｕ和２Ｕ浓度的ＤＮａｓｅｌ中具有良好的酶保护作用，可避免ＤＮＡ被ＤＮａｓｅＩ降解，比壳聚糖Ｉ巧行吏为优良的酶保护性能。－－休外转染试验中，使用ＨＥＫ２Ｗ细胞株，ＣＣＫ８法研究细胞毒性，结果远＂示ＣＳ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａｉｇ、ＣＳ５巧与ＣＳｒｇ／