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时间:2019-02-06
《n亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖非病毒转基因载体的研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、摘要本工作采用均相反应法制备N.亚甲基磷酸化壳聚糖衍生物(NMPCS),研究了其与DNA的复合能力,并将所形成的复合物用于介导体外基因转染,同时考察了载体及其复合物的细胞毒性,主要内容包括以下四个部分:(1)以红外光谱(FT-m)分析表明改性后的壳聚糖的特征基团有显著变化:13CNMR检测进一步证明了亚甲基磷酸基团的引入,结合元素分析确定了取代度。(2)通过复凝聚的方法,制备了纳米尺寸的Ⅻ仰CS/D_NA聚电解质复合物。考察了共聚物与DNA的相互作用情况,复合物中DNA的构象变化和复合物的形态和粒径。圆二色谱结果表明DNA与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复合物后仍
2、然保持着典型的B型构象。透射电镜,原子力显微镜检测结果表明,不同N/P下的N.亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖/DNA纳米复合物呈现较规则的球形,且在高电荷比时可形成尺寸较小的纳米尺度颗粒。(3)以人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa为宿主细胞,尝试了以NMPCS为载体介导含荧光素酶的pGL3质粒的体外转染,重点研究了pH值和N/P比对转染效率的影响。实验结果表明,载体可有效将质粒转染HeLa和HepG2细胞,获得的最佳转染效率远高于裸DNA和CS,与PEI相当。基于磷酸基团对钙离子有良好的鳌合能力制备了聚合物盐型NMPCS.Ca载体,并用于介导基因转染,其转
3、染过程类似于传统的P.Ca载体,并认为Ca2+离子通道促进了转染过程。考察了16一CS和NMPCS载体协同介导基因转染研究,结果表明亲疏水相互作用影响复合物的形成和基因转染活性。(4)利用MTT实验初步研究了衍生物载体及其复合物在上述两种细胞中的毒性,结果表明在实验条件下,载体和复合物的毒性要远远小于同等浓度时PEI的毒性,而载体的毒性要稍高于对应复合物的毒性,且体现一定的浓度依赖性。关键词:非病毒载体,基因运载,壳聚糖,自组装,亲水性/亲油性ABSTRACTInthisstudy,N-methylenephosphonicchitosan(卜mmCS),锄
4、amphiphilicmaeromoleculewithpowerfulchelatingabilityofCarions,Wassynthesizedandcharacterized,theinteractionsbetweenNMPCSandplasmidDNA,thegenetransfectionanddeliverymediatedbyNMPCS/DNAcomplexes,andcellcytotoxcityofthederivativeandtheircomplexeswerealsoinvestigated.Themainworkissumma
5、rizedasfollows:(1)N-methylenephosphonicchitosan(NMPCS)wassynthesizedusingaone-stepreactionthatallowedhomogeneousmodificationswithoutanysharpdecreaseinitsproperties.FT-IR,¨CNMR,andelementanalysispermittedtheidentificationofthestructureandthedegreeofsubstitutionofNNmCS.(2)NMPCS/DNAco
6、mplexeswereobtainedusingacomplexcoacervationprocess,characterizedbyagarosegelelectrophoresisretardationassayfortheirstabilities,atomicforcemicroscopy(AFM),transmissionelectronmicroscopy(TEM)andlasersizeanalysizerobservationformorphologyandsize,resultsshowedthatatchargeratio2:1orabo
7、ve,DNAcouldbecompletelyentrappedandsphericalcomplexeswithmeansizeof80-210nmwereformed,CDspectraverifiedthatthe’、interactionbetweenDNAandNA口CScausedaslightperturbationonDNAbondsandDNAstillremainedB—conformationwithinthecomplexes.(3)ComplexeswerefurtheremployedtotransfeetHeLaandHepG2
8、cells,andtransfectioneffic
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