超分子组装非病毒基因载体及其仿生特性的研究

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1、浙江大学博士学位论文摘要现代基因技术和人类基因组工程图谱的完成为采用基因分子生物学方法治疗各类疾病，提高人类生命质量提供了广阔的前景。基因治疗的研究已经深入医学研究的各个领域，成为当今最活跃的生物高技术领域之一。采用超分子组装技术制备的非病毒基因传递体系，由于具有合适的纳米尺寸、可控的结构及良好的生物相容性，显示出巨大的发展潜力及应用前景。如何提高非病毒基因载体在体内的稳定传递和高效转染是这类传递体系所需解决的关键的科学问题。病毒是由蛋白质壳层所包被的具有核壳结构的天然超分予组装体，其细胞外稳定存在、

2、细胞内解组装响应并高效转染的特点为非病毒基因传递体系的设计提供了很好的启迪。本论文以构建稳定传递和高效转染的非病毒基因传递体系为研究背景，采用超分子组装技术与基因技术相结合，制备了模拟病毒结构特点的非病毒基因超分子组装体，初步探讨了超分子组装体的结构与基因转染效率的内在联系。聚乙烯亚胺(PEl)具有的“质子海绵效应”有利于其从溶酶体中逃离出来，是目前常用的一类非病毒基因载体。但PEI／DNA组装体在生理盐溶液中不稳定、易聚集，制备PEG化的基因超分子组装体可解决上述问题。本文首先通过含PEG链段的两亲

3、聚合物的自组织共混改性，采用超分子技术构建了基于疏水作用力的新型PEG化基因超分子组装体。胆固醇一聚乙二醇(CPEG)的加入用量及次序对基因超分子组装体在生理盐溶液中的稳定性产生很大影响。将CPEG与PEl25k的混合溶液加入到等体积的DNA溶液中，制备的PEl25k／CPEG／DNA组装体在生理盐溶液中的稳定性得到很大提高；而在PEl25k／DNA组装体形成之后，再加入CPEG则不能提高其稳定性。这一现象显示新型PEG化基因组装体的形成，与疏水胆固醇参与到疏水核(由PEl25k和DNA静电中和形成)

4、的组装密切相关。研究进一步采用以表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP为模型，将制备的基因超分子组装体在生理盐溶液中放置不同的时间，并转染HEK293T细胞。荧光显微镜及流式细胞仪结果表明：随着放置时间的延长，PEl25k／DNA组装体的转染效率显著降低；而通过CPEG共混改性后的PEl25ffCPEG／DNA基因组装体由于在生理盐溶液中的稳定性得到很大提高，合适的粒子尺寸使其在体外的基因转染效率显著提高。含PEG链段两亲分子的自组织共混为制备具有新型的PEG化基因超分子组装体，提高其在生理盐溶液中的稳定性

5、及基因转染效率，提供了简单有效的新途径。浙江大学博士学位论文摘要针对基因载体与DNA分子在传递过程中的稳定缔合和在细胞内的解离释放这一对矛盾，本研究依据病毒的蛋白质壳层细胞内外响应传递的特点，开展了生物响应型非病毒基因传递体系的研究。研究利用细胞内高浓度谷胱甘肽对·s—S-键的响应特性，由低分子量PEll啪出发，通过与二甲基3，3’·二硫代-双(丙亚氨酸酯)二氯化氢(DTBP)的交联反应，合成了一系列含-S-S-键的交联聚乙烯亚胺(CLPEI)，通过对交联程度和组装条件的调控，成功制备了谷胱甘肽响应的

6、CLPEl50．／．／DNA基因超分子组装体。实验结果表明：CLPEIso％具有最佳的缔合DNA分子的能力，并在pH值为7．4到5的范围内，依然具有足够的质子缓冲能力，有利于基因超分子组装体从溶酶体中逃离出来。在pH为6．0、NaCI浓度为20mM的条件下，能与DNA形成直径在150nnl左右的球形粒子。在模拟细胞内谷胱甘肽浓度的条件下，CLPEl5似分子中．s．s．键的断裂导致高分子量聚阳离子转变为低分子量片断，实现组装体的解组装响应。体外细胞培养结果表明：这种仿生交联的基因组装体可显著降低细胞毒性

7、，并有效转染细胞。为进一步增强基因超分子组装体的稳定性和转染效率，研究以病毒组装过程中生物大分子交联的“笼状”结构为启示，开展了“笼状”仿生交联组装体的研究。合成了含巯基的聚乙烯亚胺(HS．PEI)，与DNA组装后，分别通过空气中巯基的氧化交联制备壳层原位交联的基因超分子组装体；通过金纳米粒子(AuNP)与巯基的共价缔合，制备壳层纳米金交联的组装体。荧光光谱测定结果表明：在N／P值为lO的条件下，巯基化聚乙烯亚胺(HS—PEI)能有效诱导DNA分子的缔合。在pH为6．0、NaCI浓度为20mM的HEP

8、Es缓冲溶液中，这种壳层交联的组装体的尺寸在150nm左右。对于壳层AuNP交联的Au-S．PEI／DNA组装体，由TEM图片我们可清晰观察到壳层金纳米粒子的存在，且随着AuNP加入量的增加，壳层交联的金纳米粒子含量也显著增加。与壳层未交联的基因超分子组装体相比，壳层交联的“笼状”结构可有效提高组装体在生理盐溶液中的稳定性，并显示出很好的谷胱甘肽响应特性。体外细胞培养结果表明：通过选择合适的组装条件，仿生交联的“笼状”非病毒基因传递体系可有效转染。采用超