dna甲基转移酶1在结直肠癌dna甲基化中作用机制研究

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1、分类号UDC博士学位论文密级DNA甲基转移酶1在结直肠癌DNA甲基化中作用机制的研究RoleofDNAmethyltransferase1inDNAmethylationofcolorectalcancer作者姓名：王海琴学科专业：临床医学(内科学)学院(系、所)：湘雅二医院指导老师：霍继荣教授论文答辩日期垄!量!!翌罗目答辩委员会主席中南大学二0一二年十月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南

2、大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：趔!!日期：』堡旦年二月二’日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：鱼坐年上月旦日博士学位论文中文摘要摘要目的：结直肠癌(

3、colorectalcancer，CRC)是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率高居各种恶性肿瘤第三位，在肿瘤致死的病因中居第四位。2008年全球新增癌症患者1270万人，其中绝大部分发生在发展中国家。结直肠癌发病率和死亡率居高不下的原因之一就是缺乏行之有效的早期检测和治疗方法。近年来随着表观遗传学的兴起，发现DNA甲基化不仅参与体内多种重要的生理过程，而且在众多肿瘤的发生和发展中起着重要的作用，被公认为是肿瘤常见的表观遗传学改变之一。介于肿瘤相关的甲基化事件有望成为结直肠癌防治中的重要分子靶标，因此，深入探讨DNA甲基化与结直肠癌发生、发展的分子机制，对于

4、寻求结直肠癌的临床早期诊断、治疗和预防的新途径都具有’重要的指导意义。基于上述研究现状，本研究拟从DNMTl切入，首先检测DNMTl和T-cadherin蛋白在人结直肠癌组织和相应癌旁组织的表达情况，分析结直肠癌及癌旁组织中DNMTl和T-cadherin蛋白表达水平与临床和病理的相关性。进一步在基因水平上探讨人结直肠癌组织中DNMTlmRNA的表达和T-cadherin的甲基化状况，分析其与结直肠癌发生发展的关系。接着用技术，检测DNMTlsiRNA干扰对结直肠癌细胞株DNMT酶活性的作用，明确DNMTlsiRNA对结直肠癌DNA甲基化水平的影响。最

5、后探讨DNMTlsiRNA靶向性沉默DNMTl基因对结肠癌细胞凋亡及其相关基因CDNKlA、T-cadherin、Bcl．2和l博士学位论文中文摘要Bax的mRNA表达的影响，明确DNMTlsiRNA对结肠癌细胞凋亡影响的分子机制。方法：1．收集2009年10月到2011’荤1月湘雅二医院手术切除糯梦例结直肠癌患者的结直肠癌组织和相应的癌旁组织，同时收集患煮蠛“r^-_L床资料，所有病例确诊为腺癌。采用链霉素抗生物素．过氧化酶(SP)免疫组织化学法检测结直肠癌和相应癌旁组织中DNMTl和．T-cadherin蛋白表达，DNMTl在细胞核染色判定为阳性，

6、T-cadherin在细胞膜染色判定为阳性。每张切片在高倍镜视野下，随机计数至少500个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分率。2．RT-PCR检测DNMTl基因mRNA表达情况，利用甲基化特异性PCR方法检测T-cadherin基因启动子区甲基化状况，分析结直肠癌中DNMTlmRNA的表达与T-cadherin基因启动子甲基化状况及两者之间的相关性。3．采用脂质体法DNMTlsiRNA瞬时转染人结肠癌HT-29细胞，实验分为空白对照组、阴性siRNA(15nM)组、阴性siRNA(3lnM)组、DNMTlsiRNA(15nM)组、、DNMTlsiRN

7、A(30nM)组，转染48小时候收集细胞，分别提取DNA、总RNA和蛋白质(共5组)，RT-PCR检测DNMTl基因mRNA的表达情况，WB检测DNMTl蛋白的表达情况，DNMT酶活性检测试剂盒检测瞬时转染对酶活性的影响。4．采用脂质体法DNMTlsiRNA瞬时转染人结肠癌HT-29细胞，博士学位论文中文摘要实验分为空白对照组、阴性siRNA(15nM)组、阴性siRNA(31nM)组、DNMTlsiRNA(15nM)组、、DNMTlsiRNA(30nM)组，转染48小时收集细胞，转染48小时候，MTT法测定各组结肠癌细胞的增殖情况，流式检测细胞周期和

8、凋亡情况，采用RT-PCR检测洲T1siRNA干扰对基因CDNKlA、T-cadherin、B