elmoss蛋白在乳腺癌趋化运动及转移中机制的研究

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1、学位论文原创性声明㈣本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：蕉蝴日期：≥口，弓年j月归学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查

2、阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密囹。(请在以上方框内打“√”)作者签名：垂避日期：2。B年}月雄日导师签名：这鱼日期：≥口／弓年，月彤日天津医科大学博士学位论文中文摘要研究背景和目的：乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国居女性恶性肿瘤的第一位，严重威胁着人们的生命健康。近些年来，由于对乳腺癌的早期发现，以及综合治疗手段的不断提高，其死亡率呈逐年下降趋势。然而伴有远处转移或复发患者的预后仍然很差。肿瘤转移由于治疗效果差，已经成为

3、致患者死亡的主要原因。我们的研究试图通过对乳腺癌细胞的趋化运动机制的探索来了解ELMO是如何调控乳腺癌细胞的迁移。趋化因子CXCLl2及其G一蛋白偶联受体CXCR4能够介导乳腺癌细胞的迁移，侵袭和转移。但是，目前趋化因子和G蛋白偶联受体信号通路对于肌动蛋白聚合和肿瘤细胞趋化运动的通路尚不明确。尤其是趋化因子一G蛋白偶联受体．Rac的激活．肌动蛋白聚合／ELMO蛋白，在肿瘤趋化运动和转移中是以何种机制来发挥作用的将是我们的研究重点。从而更进一步深入了解乳腺癌细胞的趋化运动和转移机制，为乳腺癌的诊断和治疗提供可靠的分子基

4、础。研究方法：1)应用WesternBlot的方法检测不同乳腺细胞中的ELMOs蛋白表达水平。2)应用WoundhealingAssay、ChemotaxisAssay、InvasionAssay、F—actinPolymerizationAssay检测ELM01蛋白降表达后，对于乳腺癌细胞迁移和趋化运动的影响。3)应用MTT方法检测ELM01是否对于乳腺癌细胞增殖有影响。4)应用质谱学分析方法，以求找到与ELM01相互作用的重要蛋白，并应用Co—IP的实验技术进一步验证。5)利用免疫荧光共聚焦的实验技术和细胞成分分

5、离的方法检测ELM01在细胞中的定位以及与Gai2共定位的现象。6)建立ELM01降表达稳定细胞系，肿瘤原位接种到小鼠脂肪垫上，构建肺转移模型，探讨ELM01降表达在小鼠体内转移的影响。7)免疫组化方法检测ELM01在人乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达，分析ELM01的表达水平与肿瘤转移等临床病理参数的相关性。天津医科大学博士学位论文结果：1)ELM01可以促进乳腺癌细胞迁移、趋化运动和侵袭的能力。我们首先观察了ELMOs蛋白在MDA．MB．231，BT549，ZR．75．30，MCF．7，T47D，BCAP一37，

6、SKBR3，MCFl0A和HBLl00的9种人乳腺细胞表达水平，ELMOl和ELM02均有不同程度的表达。并且在较高转移性的乳腺癌细胞诸如MDA—MB一231和BT549中高表达。为了研究ELMOs蛋白对人乳腺癌细胞的迁移能力影响，我们在人乳腺癌细胞MDA—MB一231和其他两个乳腺癌细胞株T47D和MCF一7采用基因沉默技术抑制ELM01的表达，然后运用体外transwell实验技术检测。我们发现，趋化因子CXCLl2对MDA．MB．231，T47D和MCF．7细胞有明显诱导的趋化作用，而基因沉默ELM01则抑制C

7、XCLl2诱导的趋化作用。另外检测表明基因沉默ELM01的细胞株表现为迁移能力降低。为了检测CXCLl2介导的MDA—MB一231细胞的侵袭能力，我们使用了体外基质胶侵袭实验技术。MDA—MB．231细胞(正常和对照组)表现出明显的侵袭能力，而siELM01细胞株则侵袭功能受到抑制。百日咳毒素(PTX)是Gai信号通路的特异性抑制剂，使用百日咳毒素(PTX)处理细胞后发现CXCLl2所介导的肿瘤细胞的趋化作用和迁移能力进一步受到抑制。在siELM01沉默表达的细胞中肌动蛋白的聚合水平则是下调的，这种下调作用在PTX作

8、用下更为明显。我们还利用了MTT的检测方法研究ELM01对乳腺癌细胞的增殖作用，结果表明siELM01细胞没有表现出对细胞增殖明显的抑制作用。2)通过质谱分析鉴定出与ELM01相互作用的蛋白质。同时，ELM01的N末端与Gai2亚基相互结合。CXCLl2的刺激可以促进Gai2与ELM01蛋白N末端的结合，并且Gai2一ELM01／DoCKl80