骨唾液蛋白（bsp）在乳腺癌骨转移中作用的研究

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1、摘要乳腺癌是目前严重威胁女性健康的一类恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤发病率的第一位。然而许多乳腺癌患者并不是直接死于原发乳腺肿瘤，而是死于肿瘤其他部位的扩散转移。其中骨是乳腺癌转移最常见的靶器官之一。深入研究肿瘤骨转移的分子和细胞学机制，可以更好的指导乳腺癌骨转移相关疾病的临床诊断和治疗。骨唾液酸蛋白(Bonesialoprotcin，简称BsP)是细胞外基质中的一种高度糖基化和磷酸化的酸性糖蛋白，富含唾液酸。其组织分布具有局限性，分布在矿化组织，包括骨、牙齿和钙化的软骨等，主要由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌，参与组织矿化，

2、与多种骨代谢性疾病有关，而近年来的研究又发现BSP与乳腺癌的骨转移密切相关。因而深入研究BsP在乳腺癌骨转移中的作用，揭示其作用枫锖噍，有可能为乳腺癌骨转移的预防和治疗提供新的药物靶点。构建hBSp稳定高表达系统是研究hBsP在乳腺癌骨转移中作用的关键，本文通过构建hBSP的真核表达载体，并转染乳腺癌细胞，进行BsP促进乳腺癌骨转移的体内外试验研究。首先梅建hBsP与绿色荧光蛋白(GFP)非融合表达的分泌型真核表达载体pIRES2_hBSP-EGFP和膜靶向定位真核表达载体pID-hBSP．EGFP。从pB．hBSP中PcR亚克隆

3、扩增带有分泌信号肽的lIl6印基因片段，插入非融合表达的真核表达载体pII瞪S2一EGFP中，获得重组表达载体pIREs2也BsP．EGFP，该载体插入^6即基因片段带有分泌信号肤可以将表达的蛋白分泌至细胞外。同时将不带信号肽的lIl扫印基因片段插入膜靶向表达载体pDispla)f中，构建真核表达载体pDisplay-hBSP，再以该载体为模板PcR扩增膜靶向定位信号肽、hBsP以及膜靶向定位蛋白基因片段，并插入plRES2．EGFP中，获得重组表达载体pID．hBsP．EGFP，该载体可将hBsP蛋白表达定位于细胞膜。将p11吨

4、S2．hBSP．EGFP和pID_hBsP．EGFP利用脂质体介导分别转染发生特异性骨转移和脑转移的乳腺癌细胞。经过转染条件的优化，最终确定96孑L培养板中细胞融合度达到90％，用lI‘g脂质体介导280ng重组质粒转染10h可获得较满意的转染效率，最高可达19．70±1．10％。由G418对乳腺癌细胞杀伤曲线试验确定稳定转染细胞G418的筛选浓度为400Ilg，ml，G418抗性筛选和流式细胞仪荧光分选获得稳定转染pIREs2-hBsP．EGFP和pID-hBsP．EGFP重组表达载体的特异性骨转移乳腺癌细胞MDA．MB．231

5、Bo(pI)和MDA．MB．231BO(pID)。细胞免疫组化结果表明乳腺癌细胞MDA．MB．231BO(DI)和华南理工大学工学博士学位论文MDA．MB．23180(pID)与未经转染的乳腺癌细胞MDA．MB．231BO均有hBsP的表达，R卫PcR结果表明经转染和未经转染的乳腺癌细胞均可检测到hBsPmRNA的表达，但MDA．MB．231Bo(p1)和MDA．MB．231BO(pID)中hBSPmRNA的表达水平分别比MDA．MB．23lBO提高1．23倍和1．1l倍。从乳腺癌细胞MDA．MB．23lBo(pI)和MDA．MB

6、一23180(pID)基因组DNA中PCR扩增出neo抗性基因，证明重组质粒已经整合到宿主基因组DNA。用sDs．PAGE和wjstern-blotting分别检测乳腺癌细胞培养上清和裂解液中hBsP的表达情况，结果发现乳腺癌细胞MDA—MB．23lBO(pI)培养上清在分子量66KD附近检测到hBsP呈阳性。乳腺癌细胞MDA．MB．23lBo(pI)和MDA—MB．231BO(pID)裂解液在分子量66KD附近检测到hBSP呈阳性。ELISA测定结果表明乳腺癌细胞MDA．MB．23lBo(pI)培养上清中hBsP的含量相对最高，

7、其次为MDA-MB一23lBo(DID)，未经转染的乳腺癌细胞MDA．MB．23lBo最低。通过对乳腺癌细胞生长特性的研究发现，稳定转染乳腺癌细胞MDA-MB一23lBO(pI)和MDA-MB-23lBO(pID)中BSP的表达并没有影响细胞的生长。克隆形成试验结果显示乳腺癌细胞MDA．MB一23lBO(pI)和MDA．MB．231Bo(pID)克隆形成率从对照组的8．90±0．53％，提高至15．6±O．94％和12．8士0．77％，说明其活性和致瘤性的增加，提示增加BsP的表达对乳腺癌细胞具有一定的自分泌促进作用。乳腺癌细胞粘

8、附试验测定结果显示贴壁细胞OD620的值从O．29±O．017增加至O．52土O．031和O．43±O．026，并且未经细胞培养上清包被的乳腺癌细胞贴壁情况测定也显示经重组质粒转染的乳腺癌细胞比未经转染的乳腺癌细胞oD620的值要有所提高，表明增加