体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导nod鼠ipscs分化为胰岛素分泌细胞实验研究

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1、f嘲燃硕士学位论文体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导NOD鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞的实验研究硕士研究生：余丹峰指导教师：蔡德鸿教授摘要研究背景l型糖尿病是一种体内胰岛素绝对缺乏所导致的以高血糖为特征的终身性疾病，其发病率正在以3-5％的速度逐年提耐¨。目前1型糖尿病患者在全球大约有2000万，中国至少有100万。1型糖尿病患者需终身胰岛素治疗以维持生命，目前尚没有有效的手段根治1型糖尿病，不合理的胰岛素补充所导致的高血糖或低血糖现象严重，以致各种并发症接踵而至，患者寿命普遍缩短。为了有效控制血糖，防止糖尿病

2、并发症的发生，提高糖尿病患者的生存质量，替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞，胰岛细胞移植蓬勃兴起【2’3】。而胰岛细胞的移植仍面临着两大难题：一、供体来源不足，二、免疫抑制药物的长期使用。自体诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)l主l于不存在伦理和免疫排斥限制【4】，有望成为诱导胰岛素分泌细胞的种子细胞【31。但是iPSCs极低的诱导效率极大制约了其在临床糖尿病治疗中的应用，如何安全高效地将自体细胞转化为iPSCs并诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞成为制约这项技

3、术发展的难点。非肥胖型糖尿病小鼠(Thenonobesediabeticmouse，NODmouse)来源于ICR鼠，是Makion等【5】于1980年通过近亲交配和选择繁殖的一组具有白内障倾向的自身免疫性糖尿病的动物模型，病状的特征为尿频、多饮、高血糖、尿酸强阳性、摘要高胆固醇血症，是目前人类研究l型糖尿病的良好动物模型【61。本实验利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾成纤维细胞中，将其诱导为NOD．iPSCs，并对其干细胞标记的表达及全能性进行了分析鉴定。由于摒弃了原癌基因c．

4、Myc，高了安全性。采用可拆分的半透膜相隔离设计【7J——建立一个胰岛细胞和iPSCs的共培养体系，在化学因子诱导分化【4J的基础上，让胰岛细胞更为精确地模仿胰腺生存的微环境，分泌可溶性因子作用于iPSCs。研究体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导是否具有更高的效率，并为之后胰岛素分泌细胞的分离纯化、功能检测、移植实验提供便利，建立优化的技术平台。第一部分目的：1．利用三因子(Oct4、Sox2、Klf4)构建NOD小鼠诱导性多能干细胞系。2．对所获得的iPSCs进行鉴定及全能性分析，以期获得与胚胎干细胞类似的多能干

5、细胞。方法：1．制备逆转录病毒：包含Oct4，Sox2和Klf4三个基因的逆转录病毒质粒pMXs—Oct3、pMXs—Sox2、pMXs-Klf4及参照质粒pMXs—EGFP购自Addgene公司，使用DH5a细菌进行扩增后将4个质粒分别转染至逆转录病毒包装细胞Plat．E，48h后收集病毒上清，过滤、浓缩后用于感染鼠尾成纤维细胞。2．分离与培养NOD鼠尾尖成纤维细胞(tail．tipfibroblasts，TTFs)：无菌分离成年的NOD鼠尾真皮，37。C下5％C02孵育5d，在这期间成纤维细胞从尾组织中迁移出来，

6、消化后接种至平皿培养。1．3代内的细胞用于iPSCs的诱导。3．逆转录病毒感染TTFs及生成iPSCs：将收集的病毒上清感染生长良好的TTFs，约1周时可首次看到iPS克隆，20d左右iPS克隆可长至足够大被挑取扩大培养。4．鉴定iPSCs的生物学特性：通过镜下观察、碱性磷酸酶染色、反转录PCRTl硕士学位论文(RT．PCR)、免疫荧光实验及畸胎瘤形成实验等对iPSCs形态、多能性基因表达情况、干细胞表面标记及全能性等进行鉴定分析。结果：1．制备逆转录病毒：逆转录病毒质粒转染Plat．E细胞48h后，荧光显微镜下可见

7、绿色荧光表达(pMXs—EGFP)，转染效率约在50—70％之问，细胞状态良好。2．分离与培养NOD．TTFs：TTFs原代培养在接种后3．4h贴壁，细胞呈长梭形、多边形或不规则形，中间1．2个圆形或卵圆形的核，原代TTFs杂细胞较多，随着传代次数的增多，其纯度增高，一般第二代后即可得到较纯的细胞。3．逆转录病毒感染TTFs及生成iPSCs：包含三个干细胞基因的逆转录病毒感染TTFs后大约一周左右可以在镜下首次看到iPS克隆，而后克隆继续增殖，12d左右形成肉眼可见的iPS集落，16．20d时克隆长至足够大，此时进行

8、挑取、消化、接种至饲细胞上传代培养。4．鉴定NOD—iPSCs的生物学特性：从TTFs获得的iPSCs镜下观察呈典型的克隆状生长，圆形或椭圆形，与饲细胞分界清楚；RT-PCR、碱性磷酸酶染色及免疫荧光检测iPSCs高表达胚胎干细胞相关基因及蛋白；种植在免疫缺陷鼠体内能够形成向内中外三个胚层分化的畸胎瘤，表明iPSCs具有多潜能性。未感染逆转录病