草莓冷诱导转录因子cbf的克隆与结构分析及其抗寒特性研究

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1、四川农业大学博士学位论文草莓冷诱导转录因子CBF的克隆与结构分析及其抗寒特性研究姓名：张勇申请学位级别：博士专业：果树学指导教师：汤浩茹20090601四川农业大学博士学位论文捅要草莓是目前果树保护地生产中种植面积最大的一个树种，由于南方冬季温度较高，草莓的越冬保护措施不严格，再加上温室的低温逆转现象，草莓在栽培过程中往往会受到偶发性的短时低温伤害，从而给草莓生产带来巨大损失。利用基因组学和分子生物学如克隆、基因操作、遗传转化等技术可以克服传统育种手段的不足，可以为研究草莓耐寒机制和抗寒育种提供新的思路和方法。CBF(CRT／DREbindingfactor，CBF)是一类与低

2、温胁迫相关的转录因子，它能够特异地结合到含有CRT／DRE元件的COR基因启动子区，从而激活COR基因的表达进而提高植物的抗寒性。因此，CBF类转录因子能够综合地改良植物的抗寒性状，是目前比较理想的植物抗逆工程基因。本试验以草莓栽培品种‘丰香’(FragariaXananassacv．Toyonaka)为试材，通过与GenBank上发表的几种植物ai珐因进行同源比较，根据氨基酸序列保守区设计简并引物，采用热启动降落PCR方法扩增得到草莓转录因子Facbfl基因的中间片段。在此基础上，通过SON-PCR和RT．PCR，从草莓中分离克隆了Facbfl基因编码区全长cDNA序列，Ge

3、nBank登录号为FJ767754。该片段长794bp，包含一个长为636bp的完整ORF，编码1个由211个氨基酸残基组成的蛋白质，预测分子量为23．4kDa，等电点为6．53。氨基酸序列分析表明FaCBFl蛋白含有一个保守的AP2结合域，在AP2结合域的两端含有两段保守的短多肽序列PKK／RPAGRxKFxETRHP和DSAWRL。利用半定量RT．PCR对Facbfl基因进行差异表达研究，结果表明Facbfl属于冷诱导差异表达基因。未经冷诱导处理的草莓幼叶内Facbfl基因不表达；经冷处理后，Facbfl在短时间内转录水平迅速增加，在12h时表达量达到高峰并可以维持至iJ2

4、4h，而在冷胁迫的后期其表达水平开始下降。分析FaCBFl蛋白的理化特性，结果表明FaCBFl属易溶、亲水性强的蛋白。系统进化树分析表明FaCBFl蛋白属于CBF基因家族，与同属植物具有比较近的进化关系。二级结构预测结果显示，FaCBFl蛋白主要以Q．螺旋和无规则卷曲两种形式出现。采用EsyPred3D同源模构建的三维模型显示，FaCBFl蛋白三维结构在N端形成一个Q．螺旋，c端形成3个B．折叠，并与GCC-box结合蛋白有着结构上的相似性。采用四川农业大学博士学位论文网络服务器对FaCBFl的功能进行了预测，结果表明FaCBFl属于CBF家族的一员，含有保守的AP2结合域，具

5、有多个磷酸化位点和O．糖基化位点，不含信号肽和跨膜结构。另外，对CBF的电子表达谱分析表明，CBF在植物中几乎整株表达，而且在多种组织和不同发育阶段均能表达，这也充分说明了CBF在植物生长发育中具有重要地位。冷驯化在轻至中等的低温胁迫时有效，如果温度过低或时间过长还会导致植物死亡。草莓幼苗经O℃低温锻炼后，各种生理指标的测试表明，草莓幼苗对低温环境具有一定的冷适应能力，即在一定程度上提高了植株的抗寒性。因此，适当的低温处理可以在一定程度上诱导草莓抗寒力的提高。这可能是外界温度下降时，植物感受低温信号，并传递低温信号到核内激活转录因子CBF，进而调节基因转录或引起一系列生理生化反

6、应，如保护酶(SOD、CAT、APx和GR等)活性提高，渗透调节物质(游离脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖)含量增加以及光合色素(叶绿素和类胡萝卜素)含量下降，并且草莓Facbfl基因的表达与这些物质的变化密切相关。由此可认为植物在低温锻炼过程中往往会发生生理和代谢上的改变从而适应低温，是一个活跃的生理生化过程，植物抗寒力的提高是低温诱导所引起的转录调控因子CBF表达水平以及一系列细胞结构和各种生理生化代谢适应性变化的综合结果。上述研究对于填补园艺植物抗寒性生理及分子生物学研究具有重要的理论意义，并可对今后其他农作物及园艺植物抗寒性的遗传改良奠定了重要的基础，具有一定的应用价值和现

7、实意义。关键词：草莓；冷诱导；CBF；基因克隆；结构分析；抗寒特性Ⅱ四川农业大学博士学位论文AbstractStrawberryproductionisthebiggestplantingareaatpresent．Thetemperatureiswarminsouth,theoverwinteringsafeguardofstrawberryisnotSeVereandthelowtemperaturereversionphenomenaoccurredSOthatstrawberrywo