冷诱导基因转录因子cbfs导入苹果与转化株系抗寒性指标分析

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1、摘要本研究以苹果(MalusdomesticaBorkh．)品种富士(Malusdomesticavat,Fuji)和营养系砧木M26试管苗为试材，采用花粉管通道法和农杆菌介导法将抗寒基因的转录因子CBFs导入节果中。通过对影响花粉管通道法进行外源基因导入苹果的适宜时期和DNA注射浓度等因素研究，初步建立了苹果花粉管通道法基因转化体系；研究了潮霉素和头孢霉素对苹果不定芽再生和继代苗的影响并进行了适宜选择压的筛选，进一步完善了苹果叶盘法基因转化体系：对转化株系进行了抗寒性状生理指标检测与筛选，明确了外源CBFs基因与节果抗寒性的相关性，并获得了抗性株系，为进一步开展利用基因工程改

2、良节果抗寒性状工作打下了良好的基础。主要研究结果如下：1．利用花粉管通道法将携带CBF3和G￡毽基因的pWBVecloa质粒DNA导入富士苹果中，探讨了DNA浓度及注射时间对转化率的影响，结果表明，当外源DNA溶液的注入对『自j控制在人工授粉后l卜，24h，浓度为1000／zg／mL时有利于提毫苹果花粉管通道法转化外源基因效率，Gc腰基因阳性表达率可达12．5％。2航生素种类和浓度对节果不定芽再生和继代苗生长影响差异较大。在以潮霉素为选择标记的节果砧木M26转化体系中，宜采用300mg／L的头孢霉素和3mg／L的潮霉素作为选择培养的脱菌浓度和选择压；用300mg／L的头孢霉素和

3、5mg／L的潮霉素作为筛选培养的脱菌浓度和选择压。3．再生株系在含5m∥L潮霉鬃的培养基上进行为期6个月的抗性筛选，对具有潮霉素抗性的转化株系进行GUS检测和PCR检测，结果表明：在检测的30个株系中有4个株系表现阳性反应颜色，G【靥基因阳性表达率为13％：有5株扩增出和阳性对照～致的特异条带，表明CaFj基因已整合至M26的基因组DNA中。4．经低温诱导转化株系叶片中的SOD、POD活性与对照相比均有所提高，随着低温诱导时问的延长其活性呈现先上升后下降最后趋于平缓的趋势，但变化幅度不同。低温诱导7h时，转CBF2基因M26试管苗叶片的SOD活性最大；低温诱导4h时，转CBF3

4、基因嘎拉试管苗叶片的SOD活性最大。低温诱导3h时，转C8一基因M26试管苗叶片的POD活性最大；低温诱导6h时，转CBF3基因嘎拉试管苗叶片的POD活性最大。5经低温诱导。转化株叶片的MDA含量和电解质渗透率与对照相比均有所降低，随着低温诱导时问的延长其表现出的变化幅度不同。6．经低温诱导转化株叶片中的脯氨酸含量与对照相比均有所提高，呈现上升后下降最后趋于平缓趋势。诱导时蒯达8h时，转CBFz基因M26试管茁叶片的腩氮酸含量最大：诱导时『白J达2h时，转car3基因嘎拉试管苗叶片的脯氨酸含量最大。关键词：={i；=果：转录因子CBF基因；再生：根癌农杆菌遗传转化；花粉管通道遗

5、传转化：生理指标TransformationofTranscriptionFactorCBFGeneandAnalysisofColdhardness-relatedIndexesinTransgeniclinesofAppleMajor：PomologyAuthor：FengSha-shaTutor：DuOuo-qiangAbstractUsingthepollentubepathwaytransformationandagrobacteria—mediatedtransformation，thetransct5iptionfactorCBFsgene，whichwascon

6、sideredtorelatetocoldhardnessinduction，wastransferredintoFujiandapplestockM26，InordertostudytheoptimumintroducingperiodandtheconcentrationofDNA．thetechniqueofpollentubepathwaywasusedtointroducegeneintoapple，allprovedthatitisfeasibletostudyfruittrees．TheeffectsofHygandCefonadventitiousbudsand

7、plantletandtheimpactofselectionpressurescreening，furtherimprovetheappleleafdiscgeneconversionsystem；rightlinesintothecoldhardinesstraitsphysiologicalindexesdetectionandscreening，clearpairofexogenousgeneandcoldresistanceofapplerelevance，andWasresist