不同剂量维生素a和d3对大鼠免疫细胞活性影响的研究

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1、青岛大学硕士学位论文能尚不明确，因此本实验主要通过给予大鼠不同剂量的维生素A和维生素D。一段时间后，观察不同浓度的两种维生素对大鼠细胞免疫功能的影响并分析两种维生素在这些指标方面的交互作用，以及补充较高剂量维生素D。对机体免疫功能的影响。从而为深入了解维生素A和维生素D。的免疫调节及合理营养补充提供科学依据。21．1．1主要仪器流式细胞仪EpicsXL·MCL(美国BECKMANCOULTER公司)；CO：培养箱MCO-20AIC(日本三洋SANYO)；96孔酶标板(Corning科技有限公司)；离心机DT5-1(北京时代：IL禾U离心机有限公司)；倒置显微镜XDS-

2、1B(重庆光学仪器厂)；电热恒温培养箱WMK一08(山东潍坊医疗器械厂)；架盘药物天平WS2-90-74(福州天平仪器厂)1．1．2主要试剂：维生素A胶丸(青岛双鲸药业公司)；维生素D。胶丸(中国厦门星鲨药业)；单核细胞荧光标记抗体(PE-anti-CDl4)(荧光素Phycoerythrin标记的人抗CDl4单克隆抗体)(美国Biolegend公司)；异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC—Dextran，分子量40000)(美国sigma公司)；大鼠淋巴细胞分离液(TBD天津灏洋生物科技有限公司)；～cellcountingkit-8(CCK-8)试剂盒(中国碧云天

3、生物科技)；ConA(刀豆蛋白A，美国sigma公司)；一级大豆色拉油(金龙鱼)；PBS粉包(北京索莱宝生物制剂)1．1．3主要试剂配置(1)刀豆蛋白A(ConA)溶液：称取5mgCoM溶解于lmlPBS中，配成5mg／ml的ConA储存液，置于-20。C冰箱避光保存备用。实验前将ConA储存液拿至室温溶解，用PBS配置成浓度为50lIg／ml待用。(2)异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC—Dextran)：称取50mgFITC—Dextran，溶解二f-50mlRPMI1640培养基中，配置成lmg／m1的溶液，4"C避光保存备用。1．2研究对象与分组取50只初t

4、籽i?LWistar大鼠，体重100-1509(山东大学实验动物中心，合格青岛大学硕士学位论文证为scxk鲁20090001)，将大鼠随机分为五组，每组10只，雌雄各半，分别为对照组、vA组(5倍生理剂量VA)、10倍VD3组(10倍生理剂量VD。)、vA+vD。组(5倍生理剂量VA和10倍生理剂量VD。)和50倍VD。组(50倍生理剂量)，均给予基础饲料(按AIN-93G配方60℃烘焙而成)。对照组大鼠按大鼠体重用大豆色拉油(1ml／kg)灌胃，摄入维生素A和维生素D。均为大鼠生理需要量(VA量为278IU／kg．d，vD。量为20IU／kg．d，按照人与大鼠剂量换

5、算系数6．25计算)；维生素补充组分别用大豆色拉油将VA、VD。胶丸稀释成不同浓度油剂后按大鼠体重lml／kg给予灌胃：vA组为VA1390IU／kg．d；10倍VD。组为Yn。200IU／kg．d；VA+VD。组为VA1390IU／kg．d+VD。200IU／kg．d；50倍VD。组为YO。1000[U／kg．d，实验为4周。实验结束时麻醉无痛处死大鼠，取大鼠血样(约5m1)离心，采用CCK一8(cellcountingkit一8)法检测淋巴细胞增殖活性和用流式细胞术检测PE—anti-CDl4标记的单核细胞荧光强度。实验期间各组大鼠自由进食、饮水，观察各组大鼠生长

6、发育状况。2．测定指标和方法2．1血样采集实验大鼠处死前夜撤食，并于次晨8时以15％乌拉坦按5ml／kg的量麻醉大鼠后经腹主动脉取血，用5毫升0．5％的肝素钠抗凝的玻璃管收集。取血后1500转／5min离心，将中间白细胞层分离出淋巴细胞cck一8法检测淋巴细胞增殖活性，分离出单个核细胞用PE—anti—CDl4标记出单核细胞后，流式细胞术检测单核细胞吞噬功能。2．2CCK一8法检测淋巴细胞增殖活性“512．2．1原理CCK-8试剂中含有WST一8化学名称为2一(2-methoxy一4一nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5一(2，4-disu

7、lfophenyl)一2H。WST一8在电子载体(1-MethoxyPMS)的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲腰物(Formazendye)，生成的甲脱物的数量与活细胞的数量成正比，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值(opticaldensity耳OOD值)，便可检测出待测细胞样品的活性。‘2．2．2主要步骤1．按照淋巴细胞分离液说明书的步骤分离得到淋巴细胞，通过预实验找到所需的最少向量、最佳的细胞浓宣和最佳的反应温度及反应时间。2．取新鲜抗凝血2m／，与0．1mmol／LPBS稀释液1：1混匀后，小心加于2ml的淋4材料与方