不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的保护机制

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1、不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的保护机制铅是严重危害危害人类健康的一种重金属元素，铅暴露对人体各组织均有毒害作用，特别是免疫毒性[1].研究发现，铅暴露可导致免疫细胞数目锐减、生理活性及增殖能力降低，相关免疫蛋白合成速度降低，机体免疫功能受损[2-6].钙作为机体所需的常量元素，有研究表明摄入适量钙可干预铅对机体的免疫损伤[7-9],但是从细胞和分子角度调控机制不明确。本研究通过建立动物试验模型，从细胞和分子角度研究不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的干预作用，从而为进一步阐明钙排铅的作用机制提供理论依据。　　　　1材料与方法　　　　1.1材料　　　　1.1.1试验动物：雄性S

2、D大鼠（出生21d,刚断乳幼鼠），平均体质量（50±5）g,共60只（北京维通利华公司）。　　　　1.1.2主要试剂：Trizol试剂、兔抗鼠IgG血清、大鼠IgG标准品、血清IgG试剂盒、总RNA提取试剂盒、PrimeScriptTMRTMasterMix反转录试剂盒、SYBRPremixExTaqTMⅡ荧光定量试剂盒（南京建成）。其它试剂均为国产分析纯。　　　　1.1.3主要仪器：D-3752高速冷冻离心机[德国赛唯斯科技（Sigma）],DNM-9606酶标分析仪（北京普朗新技术），HY-BM1160分体式石蜡包埋机（武汉汉谷医疗科技生物），Mx30

3、00P实时荧光定量PCR仪[美国安捷伦（Stratagene）],EppendorfAG核酸蛋白检测仪[德国艾本德（Eppendorf）].　　　　1.2动物分组、饲养及样品采集　　　　将60只21日龄雄性SD大鼠适应性喂养约7d后，按体质量随机分成五组：对照组（去离子水+基础饲料）；染铅组（0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料）；试验Ⅰ组（0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加0.5%碳酸钙）；试验Ⅱ组（0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加1.0%碳酸钙）；试验Ⅲ组（0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加2.0%碳酸钙）。基础饲料（山西医科大学动物中心提供）中钙含量4g/kg,铅0.

4、02mg/kg.　　　　所有试验动物均自由摄食和饮水，连续饲养60d.喂养结束后，摘除眼球采集全血，一部分用于血细胞计数，一部分室温下倾斜静置半小时，4℃、2000r/min离心10min,得血清，冷藏备用；断颈椎处死动物，取脾脏并称重记录用以计算脏器指数；一部分脾脏样品迅速在液氮中冷冻后转移至于-80℃冰箱中保存，用于荧光定量PCR检测分析；另一部分保存于40g/L多聚甲醛中固定，做切片备用。　　　　1.3脏器指数　　　　脏器指数=脏器重（mg）/体重（g）　　　　1.4细胞计数　　　　白细胞总数计数、白细胞分类计数、T淋巴细胞计数方法参照文献[10].　　　　1.5

5、大鼠血清中IgG含量测定　　　　按试剂盒说明进行测定。　　　　1.6脾脏切片制作及观察　　　　采集的脾脏组织固定24h后，制备石蜡切片并进行常规HE染色，于显微镜下观察。　　　　1.7Real-timeRT-PCR法检测脾脏中TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的相对表达量　　　　1.7.1大鼠脾脏组织总RNA的提取及反转录：提取方法参照总RNA提取试剂盒，得到的RNA进行纯度分析之后参照试剂盒步骤进行反转录，cDNA于-80℃下保藏。　　　　1.7.2引物设计：在GenBank中找到大鼠脾脏β-actin、TNF-α、I

6、L-1β和IL-6的基因序列，通过Primer5.0plμs软件设计试验所需引物，TNF-α上游引物5'-ATGTGGAACTGGCAGAGGAG-3',下游引物5'-CGAGCAGGAATGAGAAGAGG-3',产物大小150bp;IL-1β上游引物5'-TGTTTGAG-CAGCAAGGACAC-3',下游引物5'-ACTAGGCGTAC-ATGGCAACC-3',产物大小138bp;IL-6上游引物5'-AGGAAAGGAAGGGATCAAGG-3

7、9;,下游引物5'-CAGCCTTAGCATGAGGGTTC-3',产物大小96bp;β-actin上游引物5'-AGCCACCAATCCACA-CAGAG-3',下游引物5'-TACCCAGGCATTGCTGAC-AG-3',产物大小104bp.　　　　1.7.3RT-PCR反应条件：95℃10min;95℃15s,60℃36s,45个循环；72℃30s,72℃1min;95℃15s,60℃1min,95℃15s.产物保存于4℃冰箱。　　　　1.7.4标准曲线的制作：取样品cDN