三维骨骼肌组织体外构建的初步研究

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1、硕士学位论文肌细胞的生物相容性。【方法】Sylgard184双组分以10：l的比例均匀混合，倒入6孔板的其中4孔，室温下静置固化，其余2孔做为空白对照培养组(A组)；固化后的Sylgard184表面依次经过以下处理：I型胶原(CollagenI)包被(B组)、层粘连蛋白(Laminin)包被(C组)、多聚赖氨酸(poly-lysine)包被(D组)；未经包被(E组)，每组共6个样本。利用倒置显微镜观察各组C2C12细胞的生长状态，流式细胞术(FlowCytometry，FCM)检测增殖培养48h后C2C12细胞的分

2、裂增殖情况，RT．PCR检测增殖和分化培养48h后细胞内MyoD、Myogenin基因mRNA的表达。【结果】Sylgard184材料存在细胞毒性，E组接种的C2C12细胞在24h内全部漂浮死亡；D组的大多数细胞出现死亡，仅少数贴壁存活；而B、C两组材料包被后明显减少Sylagard184的毒性，增强其表面与C2C12细胞的相容性，此外，C组细胞处于合成期的百分比以及MyoD和Myogenin基因mRNA的表达水平均显著高于A、B二组(尸<0．05)。【结论】经层粘连蛋白包被修饰的Sylgard184生物相容性最佳

3、，有利于C2C12细胞的生长、增殖及分化。第二章三维极性分化肌组织的体外构建和检测【目的】利用修饰并铸型后的Sylgard184与C2C12细胞复合培养、诱导分化获取三维极性分化肌管，检测分化肌管的生长和功能特性。【方法】Sylgard184双组分以10：1的比例均匀混合，倒入6孔板中，室温下静置固化，对固化的Sylgard184表面压痕铸型(每个小的铸型凹槽宽0．8mm、深度0．15mm、长度根据需要可调整)，置生物安全柜，用Hank’s液冲洗凹槽，MatrigelIII中文摘要和胶原(混合比例1：6)混合液均匀

4、铺被凹槽底部，每个凹槽加入混合液0．3ml，放置生物安全柜，确保细胞基质材料的均匀覆盖，紫外消毒，接种密度为1．O～1．2x105／ml的C2C12细胞悬液，增殖培养48h后，待细胞增殖约80％融合时撤除全培培养基，加入含2％马血清的DMEM／F12分化培养7d后，倒置显微镜形态学观察摄片，继续分化至21d后，对所构建的骨骼肌组织进行免疫荧光检测生肌转录因子和成肌特异蛋白的表达，RT-PCR方法检测Myogenin、Desmin基因mRNAs的表达，同时采用扫描电镜观察肌管形态和肌管间的连接。【结果】C2C12细胞

5、在Sylgard184弹性体铸型压槽中培养，诱导分化7d后，倒置显微镜下观察可见肌管呈极性分化，肌管之间相互融合；继续分化到21d后，对分化形成的肌组织做扫描电镜检测，可见肌管之间排列紧密且相互重叠，形成膜样结构，厚度可达0．15mm，具有三维性；对肌管重叠构成的骨骼肌组织进行RT-PCR检测证实Myogenin、Desmin基因mRNAs的阳性表达，免疫荧光检测以及DAPI核染，进一步验证极性肌管内分化特异性标志蛋白Myogenin及收缩蛋白Desmin的表达：Myogenin阳性核染大量出现于分化肌管；骨骼肌细

6、胞骨架蛋白Desmin是特异性中间纤维蛋白，主要分布在胞浆，是肌细胞骨架的主要成份，也是骨骼肌最早的成肌标志之一，其阳性表达证实肌组织构建物的成肌特征以及极性肌管的形成。【结论】修饰并铸型的Sylgard184凹槽具有一定的方向引导效应，能促进C2C12细胞分化形成多核肌管，肌管呈极性重叠排列并构成三维骨骼肌组织。关键词C2C12细胞；细胞基质；Sylgard184；生物相容性：铸型；Matrigel极性肌管IV硕士学位论文Prelimilaryexperimentalstudyofconstructingthre

7、e--demensionalskeletalmuscletissueinvitroGraduatestudent：WangQiSupervisor：ProfessorQinJianqiang，ViceProfessorLiaoHnaABSTRACTThedevelopmentofskeletalmuscletissueengineeringwillprovidesometreatingadviceformanyskeletalmusclediseasessuchasmusculardystrophy,spinalm

8、uscularatrophy,etc．Besides，plasticsurgeryforthetreatmentoftrauma,tumorresectionanddenervation—inducedlOSSofmuscletissuewillalSObenefitfromskeletalmuscletissueengineering．Eventhough