体外构建气管黏膜上皮组织的研究

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1、体外构建气管黏膜上皮组织的研究作者：吴明明，崔鹏程，赵大庆,郑德育,段小红【摘要】目的:应用组织工程原理和方法在体外构建气管黏膜上皮组织.方法:将原代兔气管上皮细胞种植在铺有鼠尾胶原的小肠黏膜下层（SIS）上培养，在体外构建气管黏膜上皮组织，培养1wk后行HE染色，对气管上皮细胞行免疫细胞学鉴定.结果:原代气管上皮细胞培养1wk后增殖旺盛，10d时上皮细胞分布范围更广.将构建的气管黏膜上皮组织行HE染色，显示有气管黏膜上皮和SIS双层结构.抗角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学反应阳性显色率可达90%左右.结论:将铺有鼠

2、尾胶原的SIS复合气管上皮细胞生长，成功的在体外构建出组织工程化的气管黏膜上皮组织.【关键词】支气管/细胞学；上皮细胞；小肠黏膜下层；组织培养；组织工程0引言目前，在因外伤、肿瘤或其他病变导致气管大范围受损、需要切除较长段气管的情况下，尚缺乏有效的方法来修复缺损气管.9利用同种异体移植、自体组织移植以及人工材料替代物等方法，效果均不理想［1］.近年来，气管组织工程技术为这一问题的解决打开了新的视角.其中，有活性的气管黏膜上皮的重构仍是气管移植的关键.本研究在原代培养兔气管上皮细胞的基础上，将铺有鼠尾胶原的小肠黏膜

3、下层（smallintestinalsubmucosa,SIS）作为支架，复合原代气管上皮细胞生长，试图在体外构建出组织工程化的气管黏膜上皮组织.1材料和方法1.1材料健康成年大耳白兔20只，体质量（2.0±0.5）kg，雌雄不限，购于第四军医大学实验动物中心.无血清生长因子培养基(以下简称无血清培养基)成分为：1∶1DMEM/F12培养液，并加入以下激素及生长因子：10μg/mL胰岛素(INS)，5μg/mL转铁蛋白(TF)，25ng/mL表皮生长因子(EGF)，20ng/mL甲状腺素(T3)，0.4μg/mL

4、氢化可的松(HC)，1mmol/LL谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素.其中DMEM/F12培养基为Gibco产品；胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、甲状腺素以及第一抗体鼠抗兔角蛋白单克隆抗体（C1801）均为Sigma公司产品；余为国产分析纯.二氨基联苯胺DAB免疫组化试剂盒由华美公司提供.鼠尾胶原浓度为1.24g/L（钼酸比色法），由本校生物医学工程系提供.1.2方法91.2.1消毒法制备SIS将兔以20g/L戊巴比妥钠全麻致死（0.5mL/kg），无菌切取近端空肠，沿管腔的垂直面截取约10

5、cm长度数段（管壁无破损），清水冲洗干净之后浸于生理盐水中.翻转小肠，用裹着纱布的手术刀柄沿管腔纵向刮除黏膜层，直至黏膜下层.再次翻转小肠，用同样的方法刮除浆膜层和肌层，即得SIS.用生理盐水洗净小肠黏膜下层，仔细去除黏膜下层的残余组织.沿纵轴切开，切成1cm长的小段，在含青霉素、链霉素（均为200U/mL）的生理盐水中浸泡30min3次，再浸入2mL/L过氧乙酸（含50mL/L无水乙醇）消毒30min，无菌生理盐水漂洗3次，储存于无菌PBS（pH=7.4）液中4℃冰箱保存.取部分SIS行HE染色观察其结构.1.

6、2.2原代气管黏膜上皮细胞的培养将兔以20g/L戊巴比妥钠全麻致死，无菌操作取出颈段气管，用含有青霉素、链霉素（均为100U/mL）的PBS溶液冲洗气管，机械法小心剥离气管黏膜，将黏膜剪切成1mm2大小组织块；以眼科镊送入小号培养瓶内，用弯头吸管将组织块在瓶壁上均匀摆置，再将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量上述无血清培养基，将培养瓶倾斜放置在37℃细胞培养箱中，2~4h待组织小块贴附后，将培养瓶翻转平放，静置培养.以后每2d更换1次培养液，2d后小心将组织块倾倒出，继续培养细胞，10d后，细胞基本长满瓶壁后

7、，以2.5g/L胰酶进行消化，形成细胞悬液备用.91.2.3气管上皮细胞的鉴定以SP法对标本进行染色，主要实验步骤如下：①将培养10d的气管上皮细胞常规进行细胞爬片，40g/L多聚甲醛溶液固定30min；②加30mL/L过氧化氢室温孵育10min，PBS浸泡3次，每次5min；③滴加100mL/L正常山羊血清37℃孵育10min后去除多余液体；④加第一抗体，4℃过夜，PBS漂洗3次，每次5min；⑤滴加生物素标记第二抗体，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min；⑥滴加SA/HRP（辣根酶标记链霉卵白素

8、工作液），37℃孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min；⑦DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，封片.空白对照采用PBS代替一抗.二氨基联苯胺DAB显色阳性为气管上皮细胞.1.2.4复合气管黏膜上皮组织的构建在六孔培养板中放入铺有鼠尾胶原的SIS小段，将上述细胞悬液滴在其上.先不加培养液，在细胞培养箱中过夜后，再加入无血清培养基培养，以后每2d更换一次培养液.继续培养