儿童外周血成纤维细胞集落培养方法初探

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1、维普资讯http://www.cqvip.com一苏州医学院学报1998；18(tO)1015儿童外周血成纤维细胞集落培养方法初探2Z2苏州医学院人体解剖学教研室(215007)墨茁登顺苏州医学院基园工程研究室李丽螭盛伟华董宁征杨吉成摘要取健康儿童无苗外周血，用I．1l9g／ml淋巴细瞻分离液分离细胞，制成单细胞悬}瘦进行培养，培养开始时加入1，25双羟基维生素D：和碱性成纤维细胞生长困子，刺激促进成纤维前体细胞分化增殖，形成成纤维细胞集落，建立了培养方法。为儿童血循环中存在同充质干细胞的假说提供了初步实验依据，并为儿童骨角2}、肌肉营养代谢性痰病和造血系统

2、疾病研究提供了新的途径。关键词壁堑苎塑堕苎；培养；』；堑旦L拿刮午中囝法分娄R329．2’问充质干细胞具有多向分化、自我更新悬液。和增殖能力，体外培养可形成成纤维细胞集1．4．2戚纤维细胞培养：用细胞培养液调整细胞浓度至1．5×10’，L，接种于小培养方瓶中，种入细胞落(CFU—F)，经诱导可向骨、软骨、肌肉和肌约．5×10十，开始培养对加入I：25取瓷基维生腱等方向分化，并具有支持造血的功能，巴有索D】和碱性成纤维细胞生长困子，于37c，体积分不少研究者从动物和人骨髓、脐血、胎血中培数为0．05COz、饱和湿度下培养。每3～4天半量按养出CFU-F]。但尚

3、无儿童外周血形成液t次，第1t～l2天终止培养，将培养液全部倒出，CFU—F的报道，我们在此方面进行了探索，用无钙镁PBS把培养瓶轻轻洗两遍，加t0中性福初获成功，报告如下。尔马林固定lomin，再分别加入苏术素和伊红染色液，将细胞表面覆盖，行HE染色，倒置显微镜下观1材料与方法察细胞形态，并以6十以上成纤维细胞组成的集落1．1标本来源：2月，1岁摧康儿童2倒，无苗职为一十成纤维细胞集落形成单位(cFu—F)，细胞外周血2ml。数5o～100为中等集落，>100的为大集落，计数成1．2分离液的配制：取lO份5OHypaque(上海信纤维缅胞集落数。谊药厂)、

4、Z0份9F~coll(上海华美生物工程公司)1．5结果：培养第3～4天，细胞形态开始明显分配制成比重为1．119g／ml淋巴细胞分离液。化，出现散在的、棱形、多角形的成纤维细胞和大扁1．3培养体系；于含有3O小牛血清的RPMI圆内皮样细胞与单棱／巨噬细胞混杂分布，以上细胞16~0细胞培养液中加入维生素c(江苏江安制药公均贴壁生长。成纤维细胞胞体透亮，折光性好。至第司产品)50mg／L、青霉素100kU／L、链霉素lOO6～7天出现6十以上细胞组成的集落．有些集落上rag／L(华北制药公司产品)、答氮酰胺300mg／L(进有造血细胞附着。第8～9天出现细胞数大

5、于100的口)、适量1，25双羟基维生素Da(瑞士罗氏药厂产成纤维细瞻集落，而粒一单系枭落、部分混入的红系品)口和重组碱性成纤维细胞生长园子(珠海东大生枭落和红细胞等随着培养时间的延长而破碎、坏死，物制药公司产品)(“。或随着换液被逐步消除。HE染色成纤维细胞呈带1．4方法有多十小突起的梭形或多角彤．细胞棱较大．扁圆1．4．1单个掳细胞分离：用无钙镁PBS对倍稀释形，染色质颗粒细小、疏栓．故着色浅，有1～2个明的儿童外周血．经比重为1．119g／ml淋巴细胞分离显的核仁；胞浆丰富，呈泡沫状。在形成的成纤维细液分离出单个棱细胞和颗粒细胞组份．制戍单细胞胞集落中

6、，细胞数大于100十成纤维细胞的集落约占7，sO～10O的约占8，其余为6个以上细胞组-院青年基金贤助课题成的小集落(附图)。维普资讯http://www.cqvip.comACTAACADEMIAEMEDICINAESUZHOU1998；18(to)附图成纤维细胞小集落(左)，太集落(部分)×250成纤维细胞良好的生长微环境。2讨论本实验中，儿童外周血培养出的纤维样Friedenstein推测间充质干细胞——成细胞与来源于人骨髓的纤维样细胞外形相纤维细胞的前体细胞存在于外周血循环似，具有典型成纤维细胞特征。这种细胞形成中0]。目前已证实脐血和胎血中存在该前

7、体的集落我们认为应属于cFu—F，这为儿童细胞，而儿童和成人外周血体外培养一般认外周血存在间充质干细胞的假想提供的初步为不能形成CFU—F。我们认为其主要原因证据，但这种集落的生化免疫特性和细胞的是由于标本处理和培养条件不妥。鉴于儿童诱导分化机制及表型仍有待进一步研究。源于间充质的骨骼、肌肉等组织生长发育迅由于间充质干细胞具有多向分化增殖能速，我们推测其外周血存在成纤维细胞的前力和支持造血的功能，与运动系统和造血系体细胞，因此选为研究对象，同时，参照骨髓统的生长发育关系密切，本培养方法叉为儿间充质干细胞(基质细胞)和脐血成纤维细胞童外周血中成纤维前体细胞的研

8、究及儿童骨培养方法0)加以改进，初步证明培养体系中骼