胎鼠肺成纤维细胞的培养方法.docx

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1、胎鼠肺成纤维细胞原代培养摘　要：目的改良胎鼠肺成纤维细胞的培养方法方法：取19d胎龄129孕鼠,开胸取出胎肺,用胰酶稍微消化,再进行组织悬液贴壁培养。传代的肺成纤维细胞用免疫组化检测其vimentin和laminin的表达.结果24h后镜下可见组织块周边有长梭型细胞爬出，48h后生长迅速，3d接近融合。传代后杂细胞基本去除，5代后细胞的增殖能力逐渐下降。结论：胰酶轻度消化后组织悬液贴壁法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化培养方法.关键词:胎鼠 肺成纤维细胞原代培养肺成纤维细胞的体外培养（Lungfibroblasti，LF）的体外培养为研究肺的发育，肺纤

2、维化的发病机制以及其他肺部疾病的研究提供了重要的细胞模型。而胎肺成纤维细胞的培养，对于早产儿肺部疾病、肺发育以及成纤维细胞的异质性研究均有重要意义。为此，本文改良了以前我们所学过的小鼠肺原代培养技术，建立了一种胎鼠肺成纤维细胞分离纯化、培养的可靠简便方法。一、材料与方法用超纯水溶解的H-DMEM的培养基（Gibo），补加NaHCO32g/L及HEPES2g/L,过滤除菌。在-20℃以下保存备用，使用前添加15％新生牛血清（NBS）、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml。消化液：0.25％胰蛋白酶，抗vimentin(波形但蛋白)和laminin(

3、层粘蛋白)。二、实验动物年龄为7-8周的性成熟129小鼠，雌雄鼠按3:1同笼过夜，次日晨检查见雌鼠阴道阴栓针为孕0.5d。孕期满18d(足月为22天)时，进行剖宫产术取出胎鼠。三、肺成纤维细胞分离培养方法孕鼠断头处死小鼠，无菌术开胸，取出胎鼠，置于放有PBS的无菌培养皿中，取出胎肺，反复用PBS冲洗至肺组织发白，用手术剪将肺组织剪碎（小于1mm3）,移至10mL离心管中，静置5分钟后，尽量把PBS吸出，然后按1:1比例加入0.25％胰蛋白酶（37℃预温），用吸管反复吹打1分钟，加入含15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液终止消化，用吸管吹打均匀，

4、1000r/min离心3min,弃上清，再加入少量15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液悬浮组织块，加入培养液不飘起组织块为宜。每四个小鼠肺可接种在一个50mL的培养瓶中。37℃、5％co2培养箱培养，24h补加培养液后继续培养，48h换液，3d细胞接近融合时，弃去培养液，PBS清洗3次，加入0.25％胰蛋白酶消化1分钟，加入含15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液终止消化，用吸管吹打均匀，1000r/min离心3min,弃上清，再加入少量15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液，按1:2传种接代。四、免疫组化鉴定将传代的LF消

5、化制成单个细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为1×104／ml，接种于6孔板内(孔内有预先置有多聚赖氨酸涂布的盖玻片)，375％CO：培养箱常规培养，当细胞铺满盖玻片时取出盖玻片。4％多聚甲醛固定0rain，PBS洗3次，按免疫组化SABC法检测LFvimentin和laminin的表达，认真完成细胞培养和检验。五、结果⑴LF的分离纯化和扩增24h后显微镜下可见长梭型细胞从组织块中爬出．48h后细胞生长迅速，3d接近融合。在原代培养过程中，LF还混有少量的圆形Ⅱ型肺泡上皮(AECI1)，因为AECII不能传代培养。故传1代后，AECII已基本消失。LF呈星状

6、或梭形，核椭圆形，核仁明显，细胞伸出多个突起，并连接成网状。传代后的LF几乎长满整个培养瓶。偶见其他非纤维细胞，细胞增殖能力强，3—4d接近融合，连续传4～5代以后，细胞增殖能力方逐渐下降。六、免疫组化染色肺成纤维细胞呈vimentin和laminin阳性．呈棕黄色。七、讨论以往的培养法：①细胞生长缓慢，需7—10d细胞才能长满；②操作步骤较多，容易污染，对细胞损伤也比较大，且需时长，整个过程历时8h。本改良实验根据AECⅡ不能传代培养的特点，本实验采用胰酶稍微消化后的组织混合悬液进行贴壁培养。LF贴壁生长快，24h后可见组织块周围有长梭形细胞长出，第2d

7、换液后48h后生长迅速，3-4d后融合连成一片。传代后AECII基本消失，获得纯度比较高的LF细胞。有研究表明LF呈vimen和lanainin免疫反应阳性。本实验分离培养的细胞形态与贴壁生长特性及对vimentin和laminin呈免疫反应阳性等均与以前肺成纤维细胞培养研究相一致。本方法操作简单，大大缩短了时间，全程大约为1h左右，减少了污染机会，保证了细胞活力。本实验还观察到LF传代到第4～5代后．细胞的活力有所下降，做体外细胞实验的一般选用1–3代的细胞，减少污染及避免细胞活力的下降，既省时又省材料。