胎鼠听囊细胞体外培养研究

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1、胎鼠听囊细胞体外培养研究　　作者：刘晖，程随涛，许珉，梁建民，马伟军【关键词】听囊细胞；干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎鼠【Abstract】AIM:Tofindtheoriginofauditorycellsinmammalsandtostudytheproliferationanddifferentiationofauditorycellprogenitors.METHODS:Otocystepitheliasurgicallyisolatedfromfetalratsmunocytochemistry(Factin,c

2、ytokeratinandcalretinin)orphotypes,mainlyincludingepitheliallikecells,fibroblastlikeandneuronlikecells.Allofcellsaryculture.Butfeorphologicalphenotypeonthculture.CONCLUSION:Innaturalcultureconditioninvitro,otocystcellsoffetalratscandifferentiateorproliferatetoimma

3、turehaircells.Thestudyeideasandmethodsforfurtherresearchabouthaircellregeneration.【Keycells;cellproliferation;differentiation;fetalrats【摘要】目的：了解哺乳动物听觉细胞的来源，探索听觉细胞前体细胞体外增殖和分化.方法：取孕鼠胚胎听囊细胞进行体外培养，用免疫细胞化学方法，分别对培养的细胞进行细胞角蛋白、F肌动蛋白和calretinin染色观察细胞特征；BrdU染色观察细胞增殖.结果：培养的细

4、胞在体外进行分化和增殖，细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种.对细胞角蛋白和F肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色呈阳性.在原代培养就出现calretinin染色明显阳性的细胞.传代后结果仍为阳性着染，但强度减弱.BrdU染色显示培养细胞具有明显的增殖活性.本研究共传8代，历时4mo，细胞形态维持稳定.结论：胎鼠听囊细胞在体外自然培养条件下可以分化或者增殖为未成熟毛细胞.本研究为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.【关键词】听囊细胞；干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎鼠由噪声、耳毒性药物等引

5、起的耳蜗毛细胞损害而致的感音神经性耳聋是耳鼻咽喉科难治之症.如果能够建立一种细胞系，而这种细胞系又具有分化为听觉毛细胞的潜能，不但有利于听力学研究，也有利于进行药物的发展及毛细胞生物学方面的研究.我们对胎鼠听囊细胞用自然培养方法进行体外培养，并应用免疫细胞化学方法，对培养细胞进行了染色标记和观察.1材料和方法1.1材料选用怀孕14d成年健康小鼠1只，灰色，体质量0.15kg.耳廓反射正常，鼓膜正常.细胞培养基DMEM（Gibco公司）；100mL/L胎牛血清（FBS）（Sigma,USA）；2.5g/L胰酶（Sigma,U

6、SA）；抗calretininmAb(1∶100Chemicon28820SingleOakDrive.Temecula,CA92590，USA）；鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（1∶200），抗F肌动蛋白单克隆抗体phalloidinFITC（1∶200）和鼠抗体Cy3均购自Sigma公司；BrdU试剂盒（Germany）.1.2方法1.2.1听囊制备引颈法杀死实验孕鼠，取出子宫，置入放有DMEM培养液的培养皿中.用两只无菌镊撕开子宫，使胚胎与子宫内膜和胎盘游离，放入有新鲜培养液的培养皿中.在解剖显微镜下仔细分离听囊，放入准

7、备好的培养液中进行培养.本次实验共取出胎龄为14d的小鼠胚胎9只.1.2.2听囊细胞培养14个胚胎听囊上皮组织（7胚）置入PBS液中清洗2次，在显微镜下用小剪刀剪碎组织，放入含有2.5g/L胰酶的PBS液中37℃消化8min，吸液管上下吹打20次，然后加入含100mL/L胎牛血清（FBS）的DMEM液中终止消化；细胞悬液经离心后弃上清，加入培养液观察.培养液包括DMEM；L谷氨酰胺，100mg/L氨卞青霉素和100mL/L胎牛血清（FBS）.细胞悬液加入24孔培养板中在37℃,50mL/LCO2孵箱中孵育（部分培养孔放置有

8、盖玻片），每3~4d更换培养液.相差显微镜下（Nikon，日本）观察.当细胞汇合贴壁，细胞融合达80%以上时，应用2.5g/L胰酶EDTA法消化5min，进行传代.将分离的细胞用含100mL/L胎牛血清（FBS）的DMEM液进行倍数递增稀释，直至细胞浓度稀释至20×103/L，然后进行传代培养.1.2.