大鼠胎脑黑质细胞培养及pd鼠纹状体悬液微移植研究

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1、昆明医学院硕士学位论文大鼠胎脑黑质细胞培养及PD鼠纹状体悬液微移植研究姓名：王亚明申请学位级别：硕士专业：神经外科指导教师：马以骝;冯忠堂;杨志敏19990601大鼠胎脑黑质细胞培养及PD鼠纹状体内悬液微移植研究研究生：王亚明导师：马以骝教授冯忠堂教授杨志敏教授昆明医学院第一附属医院神经外科教研室摘要：胚胎中脑黑质细胞异位移植于parkinson’s患者纹状体能够发育分化，形成神经纤维再分布，对重塑重建神经功能有重要价值。目前，如何提高移植存活率和保存供体组织成为重要研究课题。在本研究中，我们对胎脑黑质细胞原代培养6天后，做免疫组化染色鉴定其生物活性，

2、进行移植质量的人为控制。然后，比较各种移植技术对移植后细胞存活率、胶质细胞反应程度及功能改善的影响。f实验动物分A、B、C、D四组。A组为假手术组，B组为立即单靶点移植组，c组为立即多靶点微移植组，D组为培养后多靶点微移植组。B、C、D组术后均有功能改善，C组各时间点均比B组改善显著(P

3、的黑质细胞能通过结构整合重塑神经功能。2．多靶点微移植较经典悬液移植技术能提高存活率和神经纤维再分布程度，减轻非特异性炎症和胶质细胞反应。3．黑质细胞体外培养为其生物活性鉴定和建立供体组织库提供实验依据。4移植实验过程中的几点体会值得注意。关键词：大鼠黑质细胞培养微移植巨移植酪氨酸羟化酶前言胚胎中脑黑质细胞异位移植于Parkinson’s病患者纹状体内，能与宿主纹状体建立广泛突触联系，替代黑质细胞退变导致的DA分泌不足，使功能恢复，为帕金森病治疗提供新的途径。““印目前，国内外研究多集中在：①如何提高移植后DA神经元存活率及神经通路重建”⋯⋯；②如何体

4、外保存供体组织二个方面"““3。自1994年Nikkhah“⋯发展单细胞悬液制各，多靶点立体定向微量注射移植(microtransplantation)技术来提高移植效果，国内尚未见此类实验探索，国内外就培养和悬液微移植技术结合的效果也少见报道。本研究对胎鼠(E14～16)黑质细胞体外原代培养，免疫组化对其鉴定，同时对移植前黑质细胞的质量和数量作人为控制，观察原代培养过程中黑质细胞生长及相应的免疫组化染色变化。并对悬液微移植与经典注射移植方法进行比较，对其细胞存活状况，胶质细胞反应和功能改善程度作评价，为改进移植技术及建立脑组织库提供实验和理论依据。材

5、料．和方法一、动物、主要试验器材和试剂1．实验动物：健康Srague-Dawley大鼠55只，雌雄不拘，体重1809一2209，妊娠14一16天的SD大鼠20只，均由云南省天然药物实验室提供。2．实验药品和试剂①6一羟基多巴胺，阿朴吗啡(SIGMA公司产品)；DNase，胰酶(华美生物技术公司产品)；水合氯醛。②Dulbec—CO’SMEM(DMEM)粉剂，F12培养基(GIBCO公司产品)；L-谷氨酰胺(华美生物技术公司产品)；新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)；氢化可的松；Hepes(华美生物技术公司产品)；胰岛素注射剂(上海生物化学

6、制药厂产品)；50％葡萄糖注射剂；D-Hank’s液；青霉素钠粉剂，链霉素钠粉剂(河北兆元药业有限公司产品)；5-氟尿嘧啶注射剂(上海旭东海普药业有限公司产品)：0．9％生理盐水，自制鼠尾胶原。③酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体(小鼠IgG)(SIGMA公司产品)；抗小鼠IGg的免疫组化染色S—Pkit，DAB显色剂，APEAS(北京中山生物技术公司产品)；triton—x-100(华美生物技术公司产品)：H202．甲醇。3．实验仪器：C02培养箱(Heraeus公司产品)，倒置相差显微镜(Nikon公司产品)，超净工作台(苏州净化设备公司产品)，解剖显

7、微镜(上海勤奋仪器厂产品)，显微手术器械，G6玻璃滤器(长春玻璃仪器厂产品)，微孔滤膜滤器(华美生物技术公司产品)，6孔、12孔培养板(Costar公司产品)，25mi培养瓶。带微电极推动器的动物脑立体定向仪(西安市西北仪器厂产品)，10u1微量注射器(上海安亭微量进样器厂产品)，拉制50—70um内径玻璃微管，骤冷冰冻切片机，free—float免疫组色器材一套。二、实验步骤1．动物PD模型制作及检测旋转行为⋯’：大鼠腹腔内注射水合氯醛(400mg／kg)麻醉，在左侧中脑一纹状体DA投射径路上选取二个毁损位点，10ul微量注射器立体定向注射6一OHD

8、A毁损液(4ug／ml6一OHDA溶以O．2mg／ml抗坏血酸盐溶液)每个位点微量注射4ul，