胎鼠肺发育中pi3k

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1、胎鼠肺发育中PI3K【关键词】丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B肺发育小鼠近交ICR［ABSTRACT］ObjectiveTostudytheeffectofPI3K-AKTsignalpathouselungdevelopment.MethodsTheexpressionofAKT,phosphorylatedAKT(pAKT)andthedoproteinsinedmunohistochemistryintheepitheliumoffetalmouselungatdifferenttimepoints.R

2、esultsice,inbredICR丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B（又被称作AKT）参与多种细胞功能，例如细胞再生、分化和存活等［1］。1-磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）可以调节AKT活性。AKT被活化后，与细胞膜分离后进入细胞核，并且在细胞核中被磷酸化后可以调节许多生物过程。据文献报道，成纤维细胞生长因子(FGFs)可以通过激活PI3K-AKT信号传导通路在许多分支器官的发育中起重要作用，例如它能促进肾脏、乳腺、前列腺等器官的发育［2］。然而，PI3K-AKT信号传导通路和肺发育的关系至今仍未清楚。据文献

3、报道，PI3K-AKT的下流效应物，如Rac1和Cdc42能刺激cyclinD1的表达［3］。cyclinD1是哺乳动物细胞循环链的关键调节器,它可以增强呼吸道上皮细胞的增生。在肺的发育过程中，决定细胞类型分化的转录因子中表面活性脱辅基蛋白C(SPC)转录因子可以加强呼吸道上皮细胞的分化［4］。然而，cyclinD1和SPC是如何通过PI3K-AKT信号传导通路来调节肺发育的仍不清楚。因此，本实验探讨PI3K-AKT信号传导通路效应物在肺发育中所起的作用。现将结果报告如下。1材料与方法1.1动物ICR

4、大鼠由日本SLC公司提供。为了得到胚胎鼠的肺，让大鼠在夜间交配，次日作为胚胎第0天（E0），胚胎鼠第12、14、16、18天（E12、E14、E16、E18）的肺被用于本实验中作蛋白印迹检测。E14和E18的胚胎鼠肺用于免疫组织化学染色。1.2g肺组织加500μL细胞裂解液（包括NP-40、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、苯甲磺酰氟）将肺组织制成匀浆。用牛血清清蛋白绘制标准蛋白曲线，检测样品蛋白浓度。取含总蛋白25μg的组织裂解产物，于120g/L的SDS-PAGE上电泳（BioRad公司，美国），转PV

5、DF膜，封闭后以1∶1000兔抗鼠单克隆抗体AKT(SantaCruz公司，美国),pAKT(SantaCruz公司，美国),cyclinD1(SantaCruz公司，美国),SPC(SantaCruz公司，美国)，β-actin(Sigma公司,日本)室温孵育2h。加入1∶5000羊抗兔IgG辣根过氧化物酶抗体(SantaCruz公司，美国)室温孵育1h。抗原抗体反应后，用ECL蛋白印迹检测系统（Amersham公司，美国）进行检测，再经X线片曝光。曝光胶片用ImageScanner(Amersha

6、m公司)扫描，ImageQuantTLV2003软件分析各条带灰度值，结果以AKT与β-actin蛋白条带灰度值的相对比值表示。AKT、pAKT、cyclinD1、SPC、β-actin组按相同实验条件重复3次，进行统计分析。1.3免疫组织化学检测在室温下，E14和E18的胚胎鼠肺放入40g/L的多聚甲醛磷酸缓冲溶液（pH7.3）中固定3h，将固定组织在磷酸缓冲液中冲洗后，用OCT混合物包埋后用液氮冷冻。取每组中的每一个OCT混合物包埋肺组织块，连续切成5μm厚的组织片置于玻片上，经蒸馏水冲洗后，按常

7、规ABC免疫组织化学法染色。pAKT（CellSignaling公司，美国）滴度均为1∶400，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染。胞核中见棕黄色颗粒为阳性。1.4统计学处理计量资料以x±s表示，用SPSS13.0软件进行统计分析。2结果2.1Western印迹检测AKT在胎儿肺组织发育过程中表达强而且无改变，各时间点比较差异均无显著意义（P>0.05）。pAKT在E12肺组织中表达最强，然后随着胎龄的增加，其表达逐渐减弱（F=58.886,q=2.384~17.289,P<0.05）

8、。cyclinD1从E12至E18表达逐渐减弱（F=18.693,q=2.544~10.194,P<0.05）。而SPC从E12至E18表达逐渐增强（F=130.290,q=7.673~26.444,P<0.05）。见图1、表1。3讨论本实验研究了鼠胎儿肺发育过程中AKT以及其磷酸化形式的蛋白质表达，并且与细胞增生及分化调节因子即细胞增生活化因子cyclinD1和细胞分化标志物SPC进行了比较。本实验结果显示，磷酸化AKT在胎儿肺发育的早期表