鼠肺成纤维细胞在细胞外基质支架中的生长特性

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1、鼠肺成纤维细胞在细胞外基质支架中的生长特性：丁浩严玉兰刘洋步雪峰【摘要】目的：研究鼠肺成纤维细胞(lungfibroblast,LF)在细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）支架中的生长特性。方法：将纤维蛋白原、层黏连蛋白和纤黏连蛋白按一定比例混合后，在新鲜大鼠血浆促凝作用下，构建单层毯状细胞外基质支架，并同时加入转化生长因子β(transforminggroratsotingcoagulationoffreshratplasma,threematerialsincludingfibrinogen，lamin

2、inandfibronectineachatacertainconcentrationonolayerECMscaffold,onthesurfaceofeansofinvertedmicroscope,immunofluorescencechemistryandscaffoldandECMscaffoldonstratedmoreactiveandhigherexpressingincellproliferation,differentiationandcollagensynthesisthanthatinthemonol

3、ayerculture.Conclusion：ThelungfibroblastsseededonECMscaffoldcouldgroodelcouldbeusedforthestudyofinterstitiallungdisease.［Keyatrix；threedimensionalculture特发性肺间质纤维化（idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF）是一种病因不明、发病机制不清、缺乏治疗手段的致命性弥漫性肺间质疾病。随着对IPF本质认识的深入，肺成纤维细胞(lungfibroblast，L

4、F)已成为IPF治疗研究的靶细胞,LF的增殖及其向肌成纤维细胞（myofibroblast，MF）的转型是影响IPF发生发展的关键。成纤维细胞的体外培养主要分单层培养和立体培养两种。目前广泛应用的是单层培养，该方法并不适于研究细胞在体内条件下的生物学行为，而三维培养的细胞更能模拟细胞在体内的生理状态。近年来随着组织工程学的兴起，人工细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)可为细胞的停泊、生长、繁殖、新陈代谢、新组织的形成等提供支持并在体外得以实现。目前国内外学者已相继建立了一系列不同的成纤维细胞三维培养方法,如

5、刘志国等［1］采用胶原凝胶系统三维培养了人皮肤成纤维细胞，但主要着重于创面修复。研究肺成纤维细胞在三维培养中特性的文献尚不多。本研究旨在运用组织工程学的方法对比LF在普通单层培养、人工合成ECM支架和加入转化生长因子β(transforminggroinin，LN；L2020）购于Sigma公司；hTGFβ1购于PeproTech公司；兔抗波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（αsmoothmuscleactin，αSMA）、Ⅰ型胶原多克隆抗体购于博士德公司；新鲜鼠血浆为未加抗凝剂大鼠全血高速离心（4000r/m

6、in，5min）后的上清，自制。1.2方法1.2.1鼠肺成纤维细胞的原代培养、传代及鉴定参照文献［2］的方法。将新生1天的SD红皮鼠肺组织修剪、消化、离心、接种，每3天换液1次。如细胞纯度不够，可采用差时贴壁法。经相差显微镜及vimentin免疫荧光鉴定，取生长状态良好的第3代细胞实验，按1×106/ml密度接种。1.2.2细胞外基质支架的制备将FN和LN溶解于无血清DMEM/F12（v/v=1∶1，pH=7.2）混合培养基后，FG溶于FN/LN混合液中，加入等体积新鲜鼠血浆可使上述FG/FN/LN胶状混合物于30min内定形，F

7、G，FN和LN在支架内的终浓度分别为50mg/ml，5μg/ml和5μg/ml。24孔培养板中即为每孔10μl的胶状混合物和等体积的新鲜鼠血浆（总体积20μl），于无菌圆盖玻片上制备成一直径12.0mm、厚度2mm透明的毯状支架。6孔培养板中为每孔加入100μl的胶状混合物和等体积的新鲜鼠血浆（总体积200μl）。1.2.3实验分组实验分为3组：①对照组（普通单层培养），②支架组（细胞外基质支架三维培养），③TGFβ组（细胞外基质支架中加入hTGFβ1三维培养）。其中TGFβ组为制备FG/FN/LN胶状混合物时加入hTGF

8、β1使其支架内终浓度为10ng/ml。1.2.4倒置显微镜观察取24孔培养板中各组生长状态良好的第14天细胞分别照相。1.2.5免疫荧光观察取24孔培养板中各组生长状态良好的第14天细胞，弃培养液，加4%低聚甲醛固定至少6h，TBS洗涤3遍，每次5