sonic hedgehog信号通路活性下调参和人类肝细胞癌中5fu抑癌作用的研究

《sonic hedgehog信号通路活性下调参和人类肝细胞癌中5fu抑癌作用的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要当代生物学和医学研究的重要目标之一是增强对肿瘤的治疗效果，最终实现彻底治疗。化疗作为肿瘤治疗的主要手段，其作用机理决定了在发生作用时缺乏选择性，对患者产生全身性的毒副作用，限制了疗效的提高。因而改进治疗方法和开发副作用小的化疗新药等成为科研人员的重要课题。目前有关化疗的研究热点主要有：一、研究和开发特异的小分子化合物或生物活性分子，来特异性激活或关闭癌细胞中与增殖、凋亡和代谢有关的细胞信号通路活性，从而提高化疗药物的特异性，增强疗效。这是提高肿瘤化疗效果的最具希望和最有潜力的途径。二、通过传统化疗药物和新药(包括新开发的具

2、有抑瘤效果的化学药物和天然药物)的相互作用，对患者联合用药，从而增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性(主要是克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性)，这是提高肿瘤化疗效果的重要途径。三、通过改善用药方式，使药物通过各种手段直接作用于局部的实体瘤，并且缓慢释放，达到长效抑制肿瘤进而杀死肿瘤细胞的效果。研究显示，动物胚胎发育过程中的一些信号通路和肿瘤的发生和发展密切相关，如Wnt、Hh、Notch和BMP信号通路等。其中Hh信号通路和肿瘤的关系是近些年的研究热点之一。Hh信号通路不但在细胞命运的决定和组织图式的形成中起到至关重要的作用，而且在肿

3、瘤发生和发展中也起到关键作用。近年来，Hh信号通路在人类肝细胞癌(HCC，Hepatocellularcaner)中的作用和意义正逐步为研究者所重视。有研究表明，SonicHedgehog(SHh)信号通路在HCC中是高频率激活的，并参与了HCC的发生和发展。因此，HCC中SHh信号通路的有关研究对以细胞信号通路为靶标的特异性治疗策略具有重要价值。但目前为止，有关HCC的研究很少涉及在化疗药物作用下SHh信号通路所发生的变化。本论文以SHh通路激活的Hep3B细胞为研究材料，重点关注传统化疗药物5-FU对SHh信号通路活性的影

4、响，以及该信号通路的活性改变是否与肝癌细胞的生长和迁移能力有关。本研究首先用MTT[3-(4，5一dimethylthiazol-2-y1)一2，5一diphenyltetrazoliumbromide】法确认了以5．FU处理Hep3B细胞系48h的半数抑制浓度为合适的工7作浓度。5．FU作用于Hep3B细胞6h，12h，24h和48h时，通过半定量RT-PCR检测，发现5．FU可以下调SHh通路靶基因P亿J『(Patched"和Glil(glioma．associatedoncogenehornolog”、配体基因SHH(S

5、onicHedgehog)和受体基因SMO(Smoothened)的表达，表明5．FU对Hep3B细胞中SHh信号通路的主要元件的基因转录有影响。而在SHh通路无活性的HepG2细胞中，没有检测到P陀J和Glil表达，配体SHH也没有受到明显影响。为确定SHh通路的活性是否参与5-FU引发的生长阻滞和细胞凋亡，本研究通过pCS2．Glil质粒使Hep3B细胞过表达Glil，用MTT检测发现，当施加相同浓度的5．FU时，转染组比非转染组的Hep3B细胞具有更高的生长曲线；台盼蓝染色实验更是直接验证了MTT的检测结果；吖啶橙荧光染

6、色实验发现，除了细胞核发生了明显的凝缩、边缘化和片段化，并有凋亡小体出现外，5-FU处理48h的转染组比非转染组的细胞凋亡比例明显减少；而用Hochest33258的荧光检测，除了发现细胞核在形态上有明显的凋亡特征外，还发现5-FU处理组比对照组的亮度强很多，荧光强度比较显著(幸，p<0．05)，而Glil转染组的Hep3B细胞与对照组相比，虽然荧光强度有所增强，但程度不明显；用TUNEL检测以及相应的荧光强度的统计学分析发现，实验中Glil转染组中TUNEL阳染的细胞数量减少，而未转染Glil的实验组中阳染的细胞数量较多，5

7、-FU引发的凋亡更为明显。本研究发现，和对照组以及5-FU处理的非转染组相比，转染组Hep3B细胞中Glil的过表达可以拮抗5．FU引发的细胞生长阻滞和细胞凋亡。使Hep3B细胞过表达Glil，从而上调SHh通路活性上调，可在一定程度上降低Hep3B细胞对5．FU的敏感性，增强Hep3B细胞对5．FU的拮抗作用。本研究的划痕损伤愈合实验发现，使Hep3B细胞过表达Glil可以拯救5．FU引起的迁移能力的降低，表明在SHh通路激活的肿瘤细胞中5-FU对细胞迁移能力的影响可能涉及对通路活性的抑制。进一步研究发现，过表达Glil的H

8、ep3B细胞可以拮抗5．FU引发的PTCl蛋白亚细胞定位的改变。本研究用荧光免疫细胞化学检测法(ICC，Immunocytochemistry)对Hep3B细胞中PTCl蛋白的亚细胞定位的变化进行了检测，发现当用5．FU处理一定时间后，大多数PTCl蛋白分子失去了它们在膜上的