v-3和bv双重rr快速检测方法的建立

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1、动物医学进展，２０１１，３２（１１）：１－５ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ檲檲檲檲殘殘檲檲殘研究论文殘檲檲檲檲＊ＢＰＩＶ－３和ＢＶＤＶ双重ＲＴ－ＰＣＲ快速检测方法的建立刘晓乐１，２，张敏敏１，２，陈颖钰１，３，胡长敏１，２，陈焕春１，２，郭爱珍１，３＊（１．华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉４３００７０；２．华中农业大学动物医学院，湖北武汉４３００７０；３．华中农业大学动物科技学院，湖北武汉４３００７０）摘要：参照ＧｅｎＢａｎｋ中登录的牛副流感病毒３型（ＢＰＩＶ－３）和牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）全基因序列，分别针对ＢＰＩＶ３特异性ＮＰ蛋白

2、保守基因和ＢＶＤＶ保守区段Ｅ２基因设计２对引物，经优化反应条件建立了快速鉴别ＢＰＩＶ－３和ＢＶＤＶ的双重ＲＴ－ＰＣＲ诊断方法。最佳扩增条件为９４℃３０ｓ，５６．２℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，循环３０次；７２℃延伸５ｍｉｎ，１６℃１０ｍｉｎ；ＢＶＤＶ引物浓度为１．０μｍｏｌ／Ｌ，ＢＰＩＶ－３引物浓度为０．５μｍｏｌ／Ｌ。采用该方法检测ＢＰＩＶ－３和ＢＶＤＶ参考病毒株，能同时扩增出预期为４２５ｂｐ和２９４ｂｐ大小的特异性片段，而扩增牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、致病性大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌Ａ型、化脓隐秘杆菌和鼠伤寒沙门菌等均呈阴性反应。对参考病毒株进行梯

3、度稀释检测，结果证明该方法检测ＢＰＩＶ－３的灵敏度可达１０－３２ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ，而ＢＶＤＶ的灵敏度达１０ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ。关键词：双重ＰＣＲ；检测方法；牛副流感病毒３型；牛病毒性腹泻病毒中图分类号：Ｓ８５２．６５３文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１１）１１－０００１－０５牛副流感病毒３型（Ｂｏｖｉｎｅｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ新引入牛群普遍发生呼吸道疾病，给养牛业造成很３，ＢＰＩＶ－３）属于副黏病毒科副黏病毒属成员，为单大危害。虽然已确定其主要病原为牛支原体，但由［１］股负链有囊膜的ＲＮＡ病毒。自从１９５９年Ｒｅｉｓ－于牛支原体常与其他

4、病原的混合或继发感染，且ｉｎｇｅｒ等在美国的牛体中分离到ＢＰＩＶ３以来，法国、ＢＰＩＶ－３和ＢＶＤＶ是牛呼吸道综合征的常见病原，前苏联、日本、丹麦、加拿大、澳大利亚、巴拿马和意故该两种病毒在牛支原体肺炎发病中的作用受到关［２］［４］大利等国也相继分离出该病毒。我国学者２０１０注。年也从国牛体内分离到ＢＰＩＶ－３病毒。为了进一步研究ＢＰＩＶ－３和ＢＶＤＶ在我国肉牛牛病毒性腹泻病毒（Ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉ－和奶牛群中的感染情况与危害程度，急需建立一种［５］ｒｕｓ，ＢＶＤＶ）为黄病毒科瘟病毒属的成员，为单股正简便、快速的诊断方法。本研究以ＢＰＩＶ－３的核蛋［３］链Ｒ

5、ＮＡ病毒。病毒感染后主要临床症状为肺白基因（ＮＰ）以及ＢＶＤＶ的Ｅ２基因为靶基因，建立炎、腹泻、繁殖障碍和黏膜病等，免疫抑制是ＢＶＤＶ了一种双重ＲＴ－ＰＣＲ检测方法。ＮＰ的一个重要功急性感染的一种表现形式，其后果是损害机体的免能是包裹着病毒的基因组，与病毒的ＲＮＡ及多聚疫机能，增强其他病原体如副流感病毒３型、传染性酶结合形成复合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，鼻气管炎病毒等其他病原的致病性。ＲＮＰｓ）。ＢＰＩＶ－３ＮＰ蛋白基因具有高度保守性，并［６］以上两种病毒混合感染在临床成为牛呼吸道疾且在ＢＰＩＶ－３感染细胞中ＮＰ蛋白含量最高。病综合征（Ｂｏｖｉｎｅ

6、ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ，ＢＶＤＶ属于瘟病毒家族，而其Ｅ２囊膜糖蛋白含有［７］ＢＲＤＣ）的主要病原。牛呼吸道疾病综合征是一种急保守的Ｃｙｓ残基和其他一些保守的氨基酸残基，性呼吸道疾病，常在经历长途运输等应激条件下发与同家族ＣＳＦＶ相比，ＢＶＤＶ和边界病病毒（ＢＤＶ）生，与多种病原相关因而该病的准确诊断方法显得Ｅ２蛋白在７４８位和７９４位有两个额外的Ｃｙｓ；非常重要。国内２００８年首次报道经长途运输后的ＢＶＤＶ的Ｅ２则在７２１位～７２２位存在２个氨基酸＊收稿日期：２０１１－０７－１１基金项目：公益性行业（农业）科研专项基金（２０１００３０６０）；现代农业（

7、肉牛）产业技术体系（ｎｙｃｙｔｘ－３８）建设专项基金作者简介：刘晓乐（１９８７－），女，新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，主要从事动物病原学研究。＊通讯作者２动物医学进展２０１１年第３２卷第１１期（总第２２１期）残基的缺失，这一缺失导致ＢＶＤＶ在这一区域存在水、琼脂糖均为Ｓｉｇｍａ公司产品；引物由上海生工着相区别的抗原表位。ＢＶＤＶＥ２的Ｎ端有两个抗生物工程技术服务有限公司合成。原决定区，一个是在种内保守的主要抗原区，另一个１．１．４参考毒株牛呼吸道合胞体病毒（Ｂｏｖｉｎｅ则是决定不同