哈密瓜果斑病菌快速检测方法的建立

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1、中国农业科学研究院硕士学位论文哈密瓜果斑病菌快速检测方法的建立姓名：回文广申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：赵廷昌20040601摘要哈密瓜细菌性果斑病在我国为新发生病害，其病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp．citrulli)，为害瓜果造成商品瓜的产量下降。近年来，果斑病的发生趋势有所上升，对我国哈密瓜生产造成严重威胁。哈密瓜细菌性果斑病菌为典型的种传细菌性病害，因此种子检疫成为防治此病害的重要手段。但常规的病种子检测方法大多存在时间过长、精度不高、专一性不强等缺点。有鉴于此，本研究建立了一套快速、准确、灵敏的

2、检测方法，用于检测哈密瓜种子携带的病原细菌。本研究配制了ASCM选择性培养基，用于果斑病菌的富集培养，同时抑制其他杂菌的生长；制备了果斑病菌的抗血清，并使用间接ELlSA法模拟种子带菌检测：设计并合成了特异性的果斑病菌PCR检测引物，在模拟种子带菌检测实验中．菌体PCR的检测精度可达3×105CFU／ml；设计了TaqMan水解探针，并使用实时定量PCR对果斑病菌进行了检测，检测精度达到3×104CFU／ml。成功地利用免疫超顺磁珠将免疫检测与PCR检测方法有机地结合起来，构建了IMS．PCR检测方法，并将检测精度提高到了3×102CFU／ml。本研究最终将

3、MOPS分离细菌、ASCM选择性培养基富集、免疫磁性分离与(实时定量)菌体PCR等技术融合成为一套种子带菌的快速检测方法(BIO．IMs巾cR)，可成功地检测山1000粒(商品)种子中的一粒带菌种子，且信号较强。此检测方法的建立，为哈密瓜生产中检测细菌性果斑病，进而为防治该病提供有力的技术支持。关键词：哈密瓜细菌性果斑病，种子带菌，快速，检测IIIAbstractHalllimelonbacterialfruitblotch(HBFB)，causedbyAcidovoraxavenaesubsp．citrulli．iSanewdiseaseinourcoun

4、try,whichdamagesthefruitsand10werstheirqualities．Thediseaseseverityisgrowingupinrecentlyyears，whichthreatentheproductionsofhamimelonseriously．HBFBisatypicallyseedbomedisease，andtheimportantpreventionandcuremethodisthequaratineoft11eseedswithbacteria．Howevegmostkindsofdetectionmetho

5、dsaretime—consuming，orindefectoflowprecisionorlowspecificity．Sointhisstudy，arapidandprecisedetectionmethodWasconstruetedforthedetectionofthebacteriainhamimelonseeds．Inthisstudy,aculturemediumnamedASCMWaSconfcctedinordertoenrichandculturetheHBFBbacteriaexclusivelywhileinhibitinggrow

6、thsofotherkindsofbacteria．Serumanti-HBFBbacteriaWasmadoandUSedforindlrectELlSA．whichstimulatedthedetectionofbacteriainseeds．AsetofspecificprimersforBFBbacteriaWaschosenandusedinPCR．TheprecisionofbacteriadetectionbyPCRWaSapp．3×10’CFU／m1．ApracticableTaqManprobeWasdesignedandcomposeda

7、ndtheprecisionofbacteriadetectionbyreal．timePCRWasaDP．3×104CFU，m1．Thentheimmuno·detectionWascombinedwithPCRbyusingthesuperparamagneticbeadstofoiTnIMS-PCR．whichincreasetheprecisionofbacteriadetectiontoapp．3×10‘CFU，m1．Inthisstudy,theintegratedmethodofbacterialdetection，whichWascalled

8、BIO·IMs-(real-time)PCR，Was