豆卜馍夜蛾热休克蛋白hsp70和hsc70基因的克隆及原核表达

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1、摘要摘要生物体受热、病原体等其他理化因素刺激后，会产生一类高度保守的热休克蛋白(heatshockproteins．HSPs)。HSPs按分子量大小通常可分为：小分子量HSP家族(smallHSP)；HSP60家族；HSP70家族；HSP90家族和HSPll0家族，其中，HSP70家族目前被认为是最重要、最保守的热休克蛋白家族。HSP70作为分子伴侣(chaperon)，能够帮助细胞内新生的肽链进行折叠，并参与其在细胞间的转运。在昆虫受到外界或内部生理变化刺激后，细胞中的一些蛋白质肽链发生伸展，失去原始盘旋和折叠的状态，从而改变

2、了分子的空间构型，使某些寡聚蛋白复合物逐渐降解，最终丧失蛋白质应有的功能。此时，HSP70迅速聚集在染色质和核质内，以特殊的方式和解聚后的染色质发生作用，防止细胞内染色质的降解，来维持昆虫细胞的内环境稳定，达到提高细胞对外界刺激的耐受性，防止昆虫细胞凋亡，加速受损昆虫细胞的修复。热休克蛋白的表达是生物体因适应环境温度变化而在分子水平上表现的最主要的变化之一。作为极为保守的蛋白，对热休克蛋白HSP70的研究，可以进一步揭示昆虫进化关系，确定昆虫种间的亲缘关系的远近。可根据昆虫在受到温度胁迫后，体内的热休克蛋白HSP70表达量的变化

3、，揭示其对生物体的保护作用。利用分子生物学技术调控昆虫的HSP70表达量，来降低昆虫对不良环境的防御能力，最终达到防控害虫的目的。HSP70在生物体的适应性和抗性机理中的作用，为寻找新型杀虫剂的靶标位点提供了新思路。豆卜馍夜蛾(Hypenatristalis)属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是大豆田中重要的食叶性害虫。根据本研究室多年田间调查害虫发生情况的结果表明，豆I-馍夜蛾在东北地区的发生量有逐年上升趋势，且具有一定的爆发性发生现象。目前，对于豆I-馍夜蛾的有关报道只局限于害虫的发生规律调查，

4、国内外尚未专门针对HSP70蛋白对豆卜馍夜蛾进行防治研究。本文通过RT-PCR法克隆得到豆卜馍夜蛾HSP70基因，成功构建起原核表达载体。并获得豆卜馍夜蛾HSP70重组蛋白，为今后研究豆卜馍夜蛾在受到热胁迫后HSP70蛋白的表达规律及热控技术防治害虫提供依据。本文研究克隆了豆卜馍夜蛾Hsp70cDNA全长序列：该序列含有2226个碱基包括一个l905个碱基的开放阅读框，编码一个含635个氨基酸残基的蛋白，分子量约为69．6kDa，等电点pI为5．36。豆卜馍夜蛾Hsp70基因具有3个典型的HSP70家族签名序列：IDLGTTYS

5、(11～18残基)，IPDLGGGTFDVSVL(199-212残基)，VVLVGGSTRIPKIQS(337～35l残基)。一个C端共识序列GPTVEEVD(629--635残基)。推导的氨基酸序列中存在5个N位糖基化位点，经SignalP4．0Server软件分析结果表明：在ORF核苷酸序列中无信号肽切割位点。豆卜馍夜蛾Hsp70基因序列已经登录GenBank并获得登录号。登录号为JQ316541。克隆了豆卜馍夜蛾Hsc70cDNA全长序列：该序列含有2198个碱基，包括一个1959个碱基的开放阅读框，编码一个含653个氨基

6、酸残基的蛋白，分子量约为71．5kDa，等电点pI为5．32。豆卜馍夜蛾Hsc70基因具有3个典型的HSP70家族签名序列：IDLGTTYS(10～17残基)，IFDLGGGTFDVSIL(198-21l残基)，IVLVGGSTRIPK(335～346残基)。一个C端共识序列东北农业大学农学硕士学位论文GPTIEEVD(646～653残基)。推导的氨基酸序列中存在6个N位糖基化位点。经SignalP4．0Server软件分析结果表明：在ORF核苷酸序列中无信号肽切割位点。豆卜馍夜蛾Hsc70基因序列已经登录GenBank并获得登

7、录号。登录号为JQ340172。通过氨基酸序列一致性比较分析，可以明显的看出，豆卜馍夜蛾Hsp70与其他昆虫Hsp70基因的氨基酸序列的相似度在79％以上。豆卜馍夜蛾Hsc70基因与其他昆虫的Hsc70基因的氨基酸序列相似度在90％以上，且差异度明显小于Hsp70基因。二者的氨基酸与其他生物的Hsc70或Hsp70的同源性是相当高的，且Hsc70基因的同源性义要明显高于Hsp70基因。应用大肠杆菌表达系统，将豆卜馍夜蛾Hsp70／Hsc70基因分别重组至UpET21b载体中，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)检测，均检测

8、到目的融合蛋白。Westernblot分析结果表明，重组质粒pET／HtriHsp70与pET／HtriHsc70原核表达结果与预期结果相符，确为豆卜馍夜蛾Hsp70／Hsc70基因的表达。关键词豆卜馍夜蛾；热休克蛋白；基因克隆；序列分析；原核表达；Wester