cgli基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能和行为的研究

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1、·英文缩略语·8中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：=豁丞区日期：丝纽辛岛之扩19中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的

2、规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：氅·中文论著摘要·cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能和行为研究目的棒杆菌是工业生产氨基酸的重要菌种。由于发酵生产的规模化和连续性，生产中极

3、易遭受噬菌体污染，严重影响企业生产过程，并给生产企业带来严重经济损失。生产中通常采用改进生产工艺，改善卫生条件，控制生产环节等措施预防噬菌体污染，虽然污染程度有所减轻，但仍时常发生。国内外一直采用菌株诱变的方法筛选抗噬菌体菌株，试图解决生产中的噬菌体污染问题。由于诱变获得的突变株存在生长缓慢，或其它生理性状改变，或生产能力下降，或只针对个别噬菌体有抗性，并易于产生回复突变等问题。所以，很难得到能用于生产的突变株。因此，噬菌体污染问题一直威胁着氨基酸的发酵生产。本文利用基因工程技术，在研究cglI基因复合体在大肠杆菌中克隆的有效方法基

4、础上，通过将含有源自谷氨酸棒杆菌的限制修饰系统cglI基因复合体导入钝齿棒杆菌构建重组菌株，以探索cglI基因复合体用于构建抗噬菌体基因工程菌的可行性，以期从根本上解决氨基酸生产中的噬菌体污染问题。同时，对携带cglI基因复合体的重组质粒的稳定性及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。方法根据GenBank中cglI基因复合体的基因序列设计PCR引物，并于两端分别引入BamHI酶切位点序列。以谷氨酸棒杆菌CICCl0226基因组DNA为模版，常规PCR扩增cglI基因片段，与克隆载体pMDl8．T连接，构建重组克隆质粒pMDl8．T

5、-cglI。菌落PCR筛选转化子，测序分析克隆的基因片段的碱基组成。BamHl分别酶切重组克隆载体pMDl8．T-cglI和棒杆菌穿梭表达载体pJL23，将回收的cglI基因片段和pJL23大片段用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌HBl01，筛选阳性克隆。制备重组质粒pJL23．cglI，酶切及PCR鉴定cglI基因片段大小和连接方向。大量制备重组质粒pJL23．cglI，电击转化到钝齿棒杆菌中，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切和PCR鉴定重组质粒后，噬菌体感染实验鉴定重组钝齿棒杆菌的功能活性。将构建的重组钝齿棒杆菌在无卡那霉

6、素的LB平板上连续传100次，再从不同传代次数平板上分别挑取100个菌落，分别接种到有和无卡那霉素的LB平板上，测定重组质粒分离稳定性，将不同传代次数的菌落接种到无卡那霉素的LB液体培养基中，利用噬菌体感染实验测定重组质粒的结构稳定性。以野生钝齿棒杆菌做对照，通过测定生长曲线研究含cglI基因复合体的重组质粒对重组钝齿棒杆菌生长的影响；通过谷氨酸含量测定研究含cglI基因复合体重组质粒对重组钝齿棒杆菌代谢的影响。结果实验结果表明，以P1／P2为引物，PCR扩增得到了与预期大小一致(2177bp)的基因片段。克隆到载体pMDl8．T后

7、，经测序分析表明，克隆的基因片段与己知的cglI基因序列同源性达100％。cglI基因与棒杆菌穿梭表达载体pJL23重组构建的重组表达质粒pJL23．cglI，转化大肠杆菌HBl01后，获得了阳性克隆菌株。经酶切和PCR鉴定证实了重组基因片段大小和正向连接方向。实验发现编码单独限制酶的基因在大肠杆菌HBl01中表达了功能活性，但cglI基因复合体在大肠杆菌中未表达功能活性。重组表达质粒pJL23．cglI导入钝齿棒杆菌中后构建的重组钝齿棒杆菌经鉴定表明重组基因片段大小和连接方向未发生变化。功能活性研究表明，构建的重组钝齿棒杆菌对其相

8、应的5种噬菌体显示了很强的限制活性，感染重组钝齿棒杆菌的噬菌体在胞内均未增殖。重组质粒pJL23．cglI在钝齿棒杆菌中的稳定性研究结果表明，重组钝齿棒杆菌连续传100代次后，重组质粒在钝齿棒杆菌中的分离稳定性和结构稳定性均达100％