资源描述：
《钝齿棒杆菌YL_1基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌中的克隆表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第。卷第期山东大学学报自然科学版年月,】‘短钝齿棒杆菌基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌中的克隆表达’马雪梅“高东蔡勉邹文徽生物系质拉为载体建立了异亮氛酸产生菌耗齿捧杆菌摘要以、,,的墓因文库并通过畴切重组于斑点杂文得到证实共筛选,个重纽子一个特定片断在库中存在的可金性达””从中克隆墓因片断的重组质拉,重组了带有转化的大肠杆菌!一,,使本来不产的大肠杆菌可
2、以积军为进一步高效表达构建工程菌创造了条件,关键词基因文库基因异亮氨酸棒杆菌引言,、、、氮基酸是人和其他生物有机体的重要组成成份在医药食品饲料农业和化工等方面都得到广泛应用一幻重组技术用于氛基酸生产菌的定向育种不仅可以打破种属,,,界限把不同菌株的优良性状集中到一株菌上而且对阐明氨基酸生产菌的遗传体系进,〔们目前遗传工程技术主要还是应行基因定位了解菌体的代谢调节机制都具有重要作用用于大,肠杆菌和枯草杆菌由于大肠杆菌带有内毒素枯草杆菌能分泌较多的胞外蛋白,,,酶所以它们都不能作为理想的发酵生产菌株而棒杆菌生长迅速有利于氨基酸的积累且人、生化、因此棒
3、杆们对它的生理氨基酸的生物合成途径及代谢调节过程都比较了解、、,菌已是世界上应用最广泛且无法替代的氨基酸核昔酸的生产菌因而其基因工程改造工作具有重要的理论和应用意义年苏联人首先成功地利用工程菌进行工业生产苏,〔氨酸现已构成多种氨基酸产生工程菌胜亦等曾在年通过克隆从、途,径的酶来提高异亮氨酸的产量’钝齿棒杆菌是经多次诱变得到的具有工业应山东大学青年科学荃金项目现中国协和医科大学荃础医学研究所博士研究生收稿日期一一山东大学学报自然科学版第卷,,用前景的异亮氨酸产生菌其与异亮氨酸合成相关的酶活性较高被选为建立基因
4、文库和克隆异亮氨酸基因的出发菌材料和方法实验用菌株和质粒培养基,,培养基麦康凯培养基配制参照文献〕基本培养、发酵培养基配制参照文献〕工具酶限制性内切酶及其它工具酶均购自百泰、华美生物工程公司重组技术,大肠杆菌质粒的提取采用碱裂解法转化采用参照文献【〕酶切、脱磷酸化、连接、片断收集等均按文献「〕介绍的方法棒杆菌高分子量染色体的提取见文献幻分子杂交生物素标记,探针的制备使用缺口平移试剂盒以及一
5、采用法染色!检测系统产品说明进行斑点杂交参照文献〔〕异亮氨酸含盘的测定,,,过夜培养物转接发酵培养基℃培养三角瓶用生长圈法川测定含量重组质粒的稳定性表实验用菌株和质粒侧」菌株和质粒荃因型来滚,斗钝齿棒杆菌,,,,,,产生本实验室保存大肠杆菌一
6、’△刁△〕〔,,,,,卜中科院徽生物所,王敖全感助,,,,,,印一诱变株本工作质粒,e,Z9La,Re+pAil本工作叮,将所得的含重组质粒的WA701(pYI94)纯化后接种lomlLB液体培养基(不含山东大学学报(自然科学版)第30卷:我们选用的出发菌株钝齿棒杆菌YL是经多次诱变得到的具有工业应用前景的异.:,亮氨酸产生菌将提取
7、的YL高分子量(图2)染色体经Hindnl部分酶切后凝胶电泳收.,YL,集>6kb的DNA片断质粒pUC19用相同的酶完全切割并脱磷酸化染色体片断与,,,酶切质粒pUC19连接后转化到大肠杆菌JM83中涂布含Ap的麦康凯培养基重组质.。白粒丧失La发酵能力而在麦康凯培养基上菌落呈白色色菌落点种于选择培养基再次,复证为了检测转化子的可靠性随机挑选8株转化子快速提取质粒进行电泳分析(图3),pUclg大,结果表明8株转化子都有质粒存在而
