异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠的影响

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1、摘要备形式。目前脂肪源干细胞的研究已成为干细胞研究的热点之一。研究表明，脂肪源干细胞易分离培养；具有多种分化潜能，甚至能够跨胚层分化，在特定的环境中可以诱导向成骨、成软骨、成脂、成肌和成神经等分化；具有低免疫原性和免疫调节功能。此外，与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相比，脂肪源干细胞来源更加广泛，获得更加容易，并且给病人带来的创伤和痛苦更小。这些特征均为脂肪源干细胞的异体移植提供了有利条件。因此，通过增加机体未分化的脂肪源干细胞，促进其向成骨分化，增加骨形成可能会对骨质疏松起到预防和治疗作用。利用糖皮质激素建立骨质疏松模型已成为比较成熟的模型。长

2、期给予大剂量的糖皮质激素可以通过引起体内钙磷代谢的紊乱，甲状旁腺素分泌增加，骨保护素分泌减少，成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细胞数量和活性增加等多种途径使骨吸收增加，骨形成减少，最终导致骨质疏松。为了探讨异体脂肪源干细胞移植对骨质疏松的预防和治疗作用，本实验通过观察移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠钙磷代谢、骨密度、骨生物力学及骨组织形态计量学等方面的影响进行综合评价，探索一种新的骨质疏松治疗方法，为临床骨质疏松的预防和治疗提供新的研究思路。目的1、分离培养脂肪源干细胞并对其多向分化能力和表面标志进行鉴定，以判断支持与储备系统中是否

3、含有未分化的脂肪源干细胞；2、通过骨密度检测判断长期给予糖皮质激素建立骨质疏松模型是否成功；3、通过血清钙、磷、碱性磷酸酶检测，观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨钙磷代谢和骨形成的影响；4、通过对骨密度的检测观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨质量的影响；5、通过三点弯曲试验观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨强度和骨刚度的影响；Ⅱ硕士学位论文6、通过骨组织形态计量学观察观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织微环境的影响；7、为“筋膜学假说"中“通过动员支持与储备系统中未分化干细胞可以治疗退行性

4、和衰老性疾病’’提供部分实验依据。方法1、取成年大鼠腹股沟皮下脂肪垫，胶原酶消化分离培养筋膜结缔组织中脂肪源干细胞。传至第6代时，分别通过形态学、成脂成骨诱导分化及利用流式细胞术对表面抗原CDllb、CD29、CD45、CD49d、CD90和CDl06进行鉴定，判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。2、40只Wistar雌性大鼠随机分成空白对照组(A组)、模型组(B组)、治疗组(C)和治疗对照组(D组)。B、C和D组分别给予颈背部皮下注射醋酸泼尼松龙注射液8mg／kg，3次／周；A组分别给予颈背部皮下注射生理盐水0．8mL，3ZR

5、／周。12周后，将A组和B组处死取材，判断造模是否成功。3、待模型建立成功后，收集传至第6代的脂肪源干细胞，经尾静脉向C组大鼠每只注射脂肪源干细胞3×106个，D组大鼠每只注射生理盐水lmL，4周后处死取材。4、水合氯醛麻醉大鼠后，心脏取血促凝管接取，室温下放置8h后3000r／min,离心15min制备血清，．70℃分装保存。用全自动生化分析仪分别利用偶氮砷III法、磷钼酸比色法和速率法测定血清中钙、磷和碱性磷酸酶的含量。取血完毕后，心脏放血处死，分别取出大鼠第三至第五腰椎和双侧股骨，去除周围肌肉组织。腰椎和右侧股骨利用双能X线骨密度仪小动物测

6、量软件测定骨密度值。左侧股骨利用BOSE生物材料动态力学试验机进行三点弯曲实验，股骨背侧向上，腹侧向下，跨距为18mm，速率为0．05mm／s，股骨压断时记录最大载荷和刚度值。5、处死后取出右侧胫骨上1／3部分，手术刀片矢状面剖开，固定后酒精逐级脱水，分别浸入浸液I(甲基丙烯酸甲酯70mL+令g苯二甲酸二丁酯30mL)、浸III摘要液II(浸液I+过氧化苯甲酰lg)和浸液III(浸液I+过氧化苯甲酰2．59)各2d，再用新鲜配制的浸液III进行包埋。JungK重型切骨机连续切取6um厚度切片，分别进行组织学观察(Gemisa染色)和类骨质观察(v

7、onKossa染色)。测量区域为生长板下lmm至4mm范围内，采用LeciaQW'm多功能彩色病理图像分析软件进行骨组织形态计量学分析。具体参数包括骨小梁相对体积(BV厂Ⅳ)、骨小梁厚度(Tb．Th)、骨小梁数量(Tb．N)和骨小梁分离度(Tb．Sp)和单位骨小梁破骨细胞数(OC．N)，均采用国际通用的公式进行计算。结果1、经光学显微镜观察，原代培养的ADSCs24h后大部分可贴壁，细胞呈圆形、多边形或者梭形。细胞长势良好，7d后可按l：3传代，之后每3d可传代一次。经换液传代至第6代，可见细胞形态均一，呈纺锤形或者多角形。体外诱导可以向成脂、成

8、骨分化。流式细胞术检测发现CD29和CD90呈强阳性，CDl06呈弱阳性，CDllb、CD45和CD49d呈阴性。2、长期大剂量给予糖皮