异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠的影响(7174)

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1、硕士学位论文异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠的影响硕士研究生：陶晖指导教师：原林教授摘要背景骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。随着骨质疏松患者不断增多，研究如何有效预防和治疗骨质疏松具有非常重要的临床价值。原林教授提出的“筋膜学假说”认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织(筋膜)支架构成的支持与储备系统和被该支架支持与包绕的已分化为各种功能细胞构成的功能系统共同组成。功能系统是建立在各种功能细胞的专能特化的基础上，而支持与储备系统是以筋膜支架中未分化的干细胞为核心。支持与储备系统中未分化干细胞通过分化为各种定向

2、干细胞，能够为功能系统中各种功能细胞的更新提供源源不断的细胞源泉，并为功能系统中各种功能细胞的代谢提供营养物质，维持内环境的稳定。因此，功能系统只有在支持与储备系统的支持下才能维持结构和功能的稳定，而一旦某种功能细胞在代谢过程中不能及时得到新细胞的补充，机体就会出现相应的病变。骨质疏松正是由于骨组织吸收后，筋膜支架中未分化的干细胞未能充分向成骨细胞分化骨形成不足而致的一种疾病。因此，当骨代谢过程中出现负平衡后，如何有效增加筋膜支架中尚未分化的干细胞，使成骨细胞得到有效的补充促进骨形成重建正平衡是治疗骨质疏松的关键。脂肪组织是支持与储备系统中重要组成部分，其中分离出的脂肪源千

3、细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)是筋膜支架中未分化干细胞的一种重要储I摘要备形式。目前脂肪源干细胞的研究已成为干细胞研究的热点之一。研究表明，脂肪源干细胞易分离培养；具有多种分化潜能，甚至能够跨胚层分化，在特定的环境中可以诱导向成骨、成软骨、成脂、成肌和成神经等分化；具有低免疫原性和免疫调节功能。此外，与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相比，脂肪源干细胞来源更加广泛，获得更加容易，并且给病人带来的创伤和痛苦更小。这些特征均为脂肪源干细胞的异体移植提供了有利条件。因此，通过增加机体未分化的脂肪源干细胞，促进其向成骨分化，增加骨形成可能会对骨质

4、疏松起到预防和治疗作用。利用糖皮质激素建立骨质疏松模型已成为比较成熟的模型。长期给予大剂量的糖皮质激素可以通过引起体内钙磷代谢的紊乱，甲状旁腺素分泌增加，骨保护素分泌减少，成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细胞数量和活性增加等多种途径使骨吸收增加，骨形成减少，最终导致骨质疏松。为了探讨异体脂肪源干细胞移植对骨质疏松的预防和治疗作用，本实验通过观察移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠钙磷代谢、骨密度、骨生物力学及骨组织形态计量学等方面的影响进行综合评价，探索一种新的骨质疏松治疗方法，为临床骨质疏松的预防和治疗提供新的研究思路。目的1、分离培养脂肪源干细胞并对其多向分化

5、能力和表面标志进行鉴定，以判断支持与储备系统中是否含有未分化的脂肪源干细胞；2、通过骨密度检测判断长期给予糖皮质激素建立骨质疏松模型是否成功；3、通过血清钙、磷、碱性磷酸酶检测，观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨钙磷代谢和骨形成的影响；4、通过对骨密度的检测观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨质量的影响；5、通过三点弯曲试验观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨强度和骨刚度的影响；Ⅱ硕士学位论文6、通过骨组织形态计量学观察观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织微环境的影响；7、为“筋膜学假说"中“通过动员支持与储备系统中未分

6、化干细胞可以治疗退行性和衰老性疾病’’提供部分实验依据。方法1、取成年大鼠腹股沟皮下脂肪垫，胶原酶消化分离培养筋膜结缔组织中脂肪源干细胞。传至第6代时，分别通过形态学、成脂成骨诱导分化及利用流式细胞术对表面抗原CDllb、CD29、CD45、CD49d、CD90和CDl06进行鉴定，判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。2、40只Wistar雌性大鼠随机分成空白对照组(A组)、模型组(B组)、治疗组(C)和治疗对照组(D组)。B、C和D组分别给予颈背部皮下注射醋酸泼尼松龙注射液8mg／kg，3次／周；A组分别给予颈背部皮下注射生理盐水0．8mL，3ZR／周。

7、12周后，将A组和B组处死取材，判断造模是否成功。3、待模型建立成功后，收集传至第6代的脂肪源干细胞，经尾静脉向C组大鼠每只注射脂肪源干细胞3×106个，D组大鼠每只注射生理盐水lmL，4周后处死取材。4、水合氯醛麻醉大鼠后，心脏取血促凝管接取，室温下放置8h后3000r／min,离心15min制备血清，．70℃分装保存。用全自动生化分析仪分别利用偶氮砷III法、磷钼酸比色法和速率法测定血清中钙、磷和碱性磷酸酶的含量。取血完毕后，心脏放血处死，分别取出大鼠第三至第五腰椎和双侧股骨，去除周围肌肉组织。腰椎和右侧股骨利