拟南芥cbf1基因的克隆及其对香蕉胚性悬浮细胞转化的研究

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1、中山大学硕士学位论文2005年5月拟南芥CBFl基因的克隆及其对香蕉胚性悬浮细胞转化的研究专业：植物学申请人：肖宁导师：黄学林教授摘要香蕉(Musaslap．)是热带、亚热带地区最重要的农作物之一，具有很高的经济价值。冷害已给香蕉的生产带来了极大的威胁，造成了巨大的经济损失。因此，培育出抗寒、抗冻的优质品种是香蕉产业持续发展的保证之一。常规育种因多数香蕉栽培种是三倍体而具有高度不育等特性而不易实现，而利用组织培养并结合基因工程技术可望实现这一目的。针对以上问题，本论文以本实验室已经建立的龙牙蕉(AAB)和贡蕉(AA)胚性悬浮系为基础，从拟南芥中克隆抗寒相关

2、基因——国仃基因并通过根癌农杆菌的介导导入龙牙蕉胚性悬浮细胞和贡蕉胚性悬浮细胞，以研究该基因的转化对上述香蕉抗寒性的影响。根据GenBank中野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)CBFl基因的cds全序列，设计特异引物扩增出该基因的开放读码框序列。同时，以pBA002和pCAMBIA2301质粒载体为基础，构建了中间载体(命名为pBACBFl)和表达载体(命名为pCAMBIA-CBFl)。pCAMBIA—CBFI质粒载体含在CaMV35S启动子调控下的CBFl基因的开放读码框序列、GUS基因和肋fⅣ基因。以根癌农杆菌EHAl05为媒介，转

3、化龙牙蕉胚性悬浮细胞和贡蕉胚性悬浮细胞，经含50mg／L卡那霉素(Kan)和适当浓度头孢拉定(Cef)(在继代过程中浓度由500mg／L降至200mg／L)的相应的培养基筛选培养，获得了拟转基因龙牙蕉植株和贡蕉体胚。占姆基因表中山大学硕士学位论文2006年5月达的组织化学染色表明不同培养阶段的龙牙蕉培养物均可显蓝色，表明GUY基因已经成功导入并整合至龙牙蕉基因组中：GUS基因的瞬时表达检测显示共培养6天的贡蕉胚性悬浮细胞培养物呈蓝色。研究结果还表明，在共培养时加入诱导剂乙酰丁香酮(AS)并不利于农杆菌EHAl05介导对贡蕉细胞的遗传转化。关键词：龙牙蕉，贡

4、蕉，胚性悬浮细胞，拟南芥CBFI基因，pCAMBIA—CBFl，根癌农杆菌EHAl05，转化，GUS中山大学硕士学位论文2006年5月CloningofCBFlgenefromArabidopsisthalianaandtheresearchofitstransformationtoembryogeniccellsuspensionsofbanana(Musa。spp)Major：BotanyName：XiaoNingSupervisor：Prof．HuangXue-linAbstractBanana(Musaspp．)isoneoftheimportan

5、ttropicalandsubtropicalcrops，andithasgreateconomicvalue．Thechillinginjuryhasseriouslyaffectedthebananayield．Therefore，breedingprogramsarerequiredinwhichcoldorchilling—resistantbananacultivarsneedstobebred，toensureitscontinuabledevelopment．Attemptsatdevelopingcultivarsresistanttoth

6、isstressusingconventionalbreedingtechniqueshavehadverylimitedsuccess，becauseofthehighsterilityandtriploidofmostbananacultivars．However,usingthegeneticengineeringtechnologiesshowsaverypotentialtoresolvethisproblem．Inthisstudybasedontheestablishmentofembryogeniccellsuspensions(ECSs)

7、oftheMusaAABSilk“Guoshanxiang”andtheMusaacuminateev．Mas(AA)atourlaboratory,weclonedtheCBFlgeneofArabidopsisthalianawhichiscorrelativetothecold．ressistantandcoldacclimation．ThentransformedittothebananaECSssoastounderstandtheeffectsofittothecold-ressitanlofbanana．ORFofCBFlgenewasclo

8、nedbyPCRandthePCRprimersweredesig