拟南芥悬浮细胞生物学及其遗传转化模式

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1、中文摘要本文从拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织生物学特性研究入手，以期制备适合农杆菌高效转化的受体材料，并制定科学、合理、有效的转化方案；利用所构成的多个质粒载体，进行拟南芥悬浮细胞基因转化，以检验多种转化方案的可行性，并优化转化条件：检测转化细胞报告基因的瞬时表达和稳定表达，以期建立有效的转化模式，并获得可利用的转化材料。本论文所做的主要工作如下：1、拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织生长特性与培养条件试验研究了拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织的生长特性及其继代培养条件，旨在摸索维持拟南芥悬浮细胞正常稳定生长的培养技术，并为拟南芥悬浮细胞进一步的遗传操作提供良好的受体材料和科学依据。结果表明，在每个7d一次的继

2、代周期中，拟南芥悬浮细胞的生长表现明显的S型生长曲线。正常培养条件下，继代后2-4d出现快速生长时期，此后生长量迅速下降，但接种量不同，其继代后悬浮细胞生物量及快速增长发生时期不同。维持7d继代周期的理想接种量为起始悬浮液按10ml／50ml稀释。接种量小，生长迟缓，甚至不能增殖。培养基中不同激素及不同蔗糖含量均会对其生长产生极明显的影响，在B5+0．2mg／LNAA条件下反复继代后的细胞，再加入外源NAA．时，反而会抑制其生长。蔗糖含量以309／L最好；蔗糖含量低，悬浮生物量及细胞活性明显下降。拟南芥愈伤组织生长也呈现一定的规律性，正常条件下，需经历约各10d的诱导时期、快速生长时期和生长停

3、滞及老化时期。愈伤组织诱导及其生长对外界条件也特别敏感，一定的表面湿度及较低的培养温度是必须的。2、拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对抗生素的反应试验研究了拟南芥悬浮及其愈伤组织对潮霉素、卡那霉素、头孢霉素等3种抗生素的反应，为拟南芥悬浮细胞转化子抗生素选择浓度和选择方案的制定提供依据。结果表明：潮霉素对拟南芥悬浮细胞生长、愈伤组织诱导及其生长均有极明显的抑制作用，但作用效果和特性均有所不同。拟南芥悬浮细胞继代培养阶段、愈伤组织诱导阶段和愈伤组织增殖阶段的临界致死浓度分别为25，2．5，1．5mg／L，液体与固体培养条件下差异极大。当采用潮霉素抗性标记筛选转化子时，应当分别采用相应阶段的临界致死浓度

4、作为转化子选择浓度。与此同时，潮霉素需要一定处理时间才能充分表现其抑制细胞生长或杀死细胞的效果，一般液体培养条件下3d以后、固体培养条件下5d以后效果趋于稳定，但不同的处理浓度有较大差异，建议选择时间在液体培养条件下不少于3d，在固体培养条件下不少于5d。否则，假阳性率会很高，从而大大加重后续转化子检测的工作量。卡那霉素与潮霉素有类似的影响，在愈伤组织诱导阶段，适宜的选择浓度为50mg／L，根据潮霉素作用特性推测，其在液体培养阶段和愈伤组织生长阶段的适宜选择浓度分别在100mg／L、25mg／L左右。后续的转化试验中，若利用卡那霉素选择，我们将采用这一选择浓度。试验中意外发现头孢霉素能促进绿色

5、悬浮细胞的获得，并具有逆转悬浮细胞“白化”的稳定效果。有关悬浮细胞“白化”原因及头孢霉素逆转效应机理，有待进一步研究。3、拟南芥悬浮细胞耐受性试验选择与其遗传转化相关的常温静置、低温静置、高温振荡、蔗糖饥饿和常温振荡(对照)几种不同处理方式，从其生长和细胞活性两个方面，研究其对环境胁迫的耐受性，以更好地制定拟南芥悬浮细胞基因转化时细胞同步化或预处理及共培养的方案和条件。结果表明：拟南芥悬浮细胞对各种胁迫处理的耐受性表现出明显的差异，整体耐受性强弱依次为：常温振荡(对照)>蔗糖饥饿>高温振荡>低温静置>常温静置，常温静置最低。拟南芥悬浮细胞对胁迫处理的不适应表现在多个方面，总生物量增长很少或不能

6、增长，细胞相对活性及活细胞生物量不断下降，耐受系数低。随着时间的变化，拟南芥悬浮细胞对胁迫处理的耐受性或不适应性的表现呈现不同的变化规律，这种变化的可能机制与细胞间协同与竞争、细胞自我适应机制的调节等有关。4、拟南芥悬浮细胞超低温保存试验探索一般实验室条件下拟南芥悬浮细胞的简便保存技术，为中长期保存遗传背景稳定一致的拟南芥悬浮细胞起始材料提供有效的方法。通过一系列试验，本文获得了拟南芥超低温保存的适宜方法。优化方案如下：选择继代后2d的拟南芥悬浮细胞，洗涤1次，细胞沉淀重悬浮于6％蔗糖培养基，于40C低温下锻炼6h；浓缩细胞使之有较高的细胞密度(0．25-0．309／m1)，加入16％(W／V

7、)甘油作为冰冻保护剂，直接置于一80℃深冷冰箱保存；使用时以37℃快速解冻，离心后除去保护剂，然后可用去离子水洗涤后进行活性检测，也可用基本培养基洗涤后重新进行悬浮培养。此方法保存30d后的细胞相对活性达O．8左右，可以满足实验室一般研究用。如果对其保存后的活性要求不很严，还可以进一步简化，例如，预处理前以悬浮细胞自然沉降代替离心洗涤后收集细胞沉淀：免去高渗预处理，直接加入冰冻保护剂后在低温下锻炼