拟南芥AtLACS9和AtGPAT9基因的克隆及大豆的遗传转化

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1、-摘要三酯酰甘油（Triacylglycerol,TAG）是植物油的主要化学成分。脂酰辅酶A（Acyl-coenzymeA,Acyl-CoA）和甘油-3-磷酸（Glycerol-3-phosphate,Gly3P）是合成TAG的前体。长链脂酰辅酶A合成酶（Long-chainAcyl-CoAsynthetase,LACS）可催化种子中脂酰辅酶A的合成。甘油-3-磷酸酰基转移酶（Glycerol-3-phosphateacyltransferase,GPATs）则催化脂酰辅酶A中的脂肪酰基对甘油-3-磷酸分子sn-1位的酯化反应，形成溶血磷酯酸（Lysophosphatidic

2、acid,LPA），从而启动TAG的合成。因此，LACS和GPAT是植物种子中TAG合成的关键酶，直接影响种子含油量。模式植物拟南芥同时也是高油分植物，目前对其AtLACS和AtGPAT基因家族的研究较为深入，其中AtLACS9和AtGPAT9基因在种子TAG的合成中可能起重要作用。本论文克隆了这2个基因并将其中AtLACS9基因转化大豆，旨在获得油分含量提高的转基因大豆。主要研究结果如下：（1）将大豆种子凝集素基因的启动子（lec）从pBI-lec载体上酶切下来，连接到植物表达载体pCAMBIA3301（p3301）的多克隆位点上，构建成p3301-lec载体。（2）用RT

3、-PCR方法克隆了拟南芥AtLACS9基因的编码区cDNA，并将其连接到p3300载体的35S启动子和p3301-lec载体的lec启动子之后，构建成组成型和种子特异性表达载体。（3）用RT-PCR方法克隆了拟南芥AtGPAT9基因的编码区cDNA，并将其连接到p3301载体的35S启动子之后，构建成超表达载体，然后将其转入农杆菌，为进一步转化大豆做好了准备。（4）用冻融法将p3301-lec-AtLACS9载体转入农杆菌，再用其介导的子叶节法转化大豆，经筛选获得抗性绿芽和再生植株，目前正在用PCR方法进行转基因植株的分子检测。关键词：AtLACS9；AtGPAT9；基因克隆

4、；载体构建；大豆转化---CloningofAtLACS9andAtGPAT9fromArabidopsisandtheTransfomationofSoybeanAbstractTriacylglycerol(TAG)isthemajorformofstoragelipidinoilseeds,andacyl-coenzymeA(Acyl-CoA)andglycerol-3-phosphate(Gly3P)areprecursorsforthebiosynthesisofTAGs.Long-chainAcyl-CoAsynthetases(LACSs)catalyzethe

5、synthesisofacyl-CoA.Glycerol-3-phosphateacyltransferases(GPATs)catalyzetheacylationofglycerol-3-phosphateatthesn-1positionwiththeAcylgroupfromAcyl-CoAandresultintheformationoflysophosphatidicacid(LPA),whichistheinitialstepofTAGbiosynthesis.Therefore,bothAtLACSsandAtGPATsarethekeyenzymesofTA

6、Gbiosynthesisinplantseeds,whichinfluencetheTAGcontentinseedsdirectly.ThemodelplantArabidopsisthalianaisasortofhigh-oilplant.Uptothepresent,researchesaboutitsAtLACSandAtGPATgenefamlilyhaveproceededgreatly,andthegenesencodingAtLACS9andAtGPAT9enzymesarepredictedtoplayimportantrolesinseedTAGbio

7、synthesis.Inthispaper,boththetwogeneswereclonedandthetransformmationofsoybeanwithAtLACS9genewasperformedaimingatenhancingtheoilcontentofsoybeanseeds.Themainresultsareasfollows:(1)Thesoybeanseed-specificlectinpromoter(lec),whichwasdigestedwithrestrictione