利用植物生物反应器制备白藜芦醇的相关研究

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1、山东师范大学硕士学位论文利用植物生物反应器制备白藜芦醇的相关研究——花生中自藜芦醇合酶I(PNRSl)的分离及其在植物中的功能研究中文摘要植物生物反应器是指通过基因工程途径，将常见的农作物进行大规模种植从而生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂。具有经济、高效、安全的特点，其应用能够满足科研及人们日益增长的健康、保健的需求。白藜芦醇(Resveratrol，简称Res)是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种植物抗毒素，还具有抗癌、抗氧化、调节血脂，影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。自然的条件下Res在植物

2、体内的含量非常低，且用传统的提取方法获得高丰度的Res非常困难。白藜芦醇合酶(Resveratrolsynthase，简称RS)是Res合成途径中最后一个起作用的关键酶，也是唯一必须的合成酶。本实验通过分子生物学手段，分离得到花生白藜芦醇合酶基因(PNRSl)的基因组DNA和eDNA，通过构建不同的表达载体，分别对大肠杆菌和植物进行遗传转化，己经取得了如下进展：利用RT-PCR技术从花生根部cDNA@扩增出户M2田基因的eDNA(登陆号：FM955393)，然后将其重组到克隆载体中。通过测序并进行序列比对证明，所获得的PNRSl基因与登陆号为AYl70734的序列同源性达到95％。其编码

3、的氨基酸序列与登陆号为AA011837的氨基酸序列同源性达到96％，且序列中包含有RS的特征结构及活力位点，成功获得了花生E．PNRSl基因的cDNA。RT．PCR分析表明，PNRSl在花生根中特异表达，并可被紫外诱导表达。将测序正确的烈碾肼基因与原核表达载体pET-28a融合获得读框正确的表达载体pET-28a-PNRSl。该载体转化大肠杆菌感受态后，经IPTG诱导后PNRSl能够正确表达，融合蛋白分子量约为46KD，与预期相符，且最适IPTG诱导浓度为1mmol／L，最佳诱导时间为3h。证明实验中成功构建了花生RS的原核表达载体，优化了RS高效表达体系，为进一步深入研究花生RS的功能

4、打下了基础。同时，将测序正确的花生．RSeDNA基因分别正向、反向插入到植物表达载体pBll21和修饰过的pCAMBIAl301的CaMV35s启动子和NOS终止子之间，成功获得植物表达载体pBRS和p1301．35s．RSl。经农杆菌介导转入烟草，获得了若干转基因植株。利用紫外分光光度法及HPLC对部分转基因植株进行了白藜芦醇含量测定，证明白藜芦醇含量较对照植株均有提高。本实验在传统育种的基础上，通过基因工程手段，获得了花生RS基因并将其导入植山东师范大学硕士学位论文物中，得到了Res含量变化及抗环境恶化能力提高的株系，为进一步将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济

5、附加值的提高及作物抗逆性育种提供了指导。它的开发和利用，必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。关键词：自藜芦醇(Res)；白藜芦醇合酶(Rs)；花生PNRSl基因克隆；原核蛋白表达；紫外线损伤。分类号：Q78Il山东师范大学硕士学位论文InvestigationofResveratrolPreparationbyPlantBio·-reactor———-Isolationofpeanutresveratrolsysthesisenzyme1(PNRSl)anditsfunctionalanaysisinplantsAbstractPlantbio-reactormeanst

6、ousetransgenicplantstoproducebiologicalagents，suchasrecombinantpharmaceuticalproteins，industrialenzymes，lipidsandsecondarymetaboliteset．al，bygeneengineeringmethodwiththeadvantagessuchasenconomy，highefficiencyandsafty．Itcouldprovidevirtuallyunlimitedquantitiesofproteinstomeettheincreasedrequirment

7、sforbothhumanhealthcareandthebioscienceresearch．Resveratrol(Res)isanaturallyoccurringstilbene，akindofpolyphenoliccompounds，foundinalimitednumberofunrelatedplantspecies．Ithasbeenconsideredasaphytoalexininplants，andmanys