肺癌干细胞的分离、鉴定与耐药特性的初步的的研究

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1、摘要的培养箱中进行传代培养；A549细胞球：DMEM／F12培养基(胰岛素4U／L+B27Ix+EGF201．tg／L+bFGF20肛g／L)，37"C、饱和湿度下5％C02的培养箱中进行传代培养；2．流式细胞技术检测干细胞标志物CDl33的表达；3．免疫荧光激光共聚焦显微镜检测其干细胞标志物CDl33和CD44s的表达情况：4．MTT法检测细胞增殖、半数抑制浓度(IC50)；5．流式细胞技术及免疫荧光检测细胞凋亡、细胞周期：6．Westernblot及免疫荧光检测GST-g蛋白的表达；7．RT-PCR检测MRPl、LRP基因的表达；8．NO

2、D／SCID小鼠致瘤实验。结果1．无血清悬浮培养法能够培养出A549细胞球，倒置相差显微镜下观察：大小不一的球状细胞团，悬浮于培养基中，细胞球由10至20个细胞组成，结构较致密而不易吹散，相差显微镜下透亮，折光性较强。2．流式检测A549细胞球和A549细胞系CDl33的表达有差异。A549细胞球CDl33的表达为(66+1．23)％，A549细胞系CDl33的表达为(10．2+0．83)％，n=3，P<0．05。3．免疫荧光激光共聚焦显微镜检测显示A549细胞球表达CDl33、CD44s干细胞标志物。4．MTT法检测显示：A549细胞球倍增

3、时间为53．96h，A549细胞系倍增时间为75．6h，A549细胞球对顺铂(Cisplatin，DDP)和吉西他滨(Gemcitabine，GEM)的耐药性较其细胞系强，Cisplatin对A549细胞球和A549细胞系的IC50分别为18．25士0．66mg／L和3．8q-0．36m∥L，Gemcitabine对A549细胞球和A549细胞系的IC50分别为280．38士8．2mg／L和189．47：k5．65mgm，P<0．05。5．流式细胞技术检测细胞周期、细胞凋亡结果显示；A549细胞球和A549细胞系的周期分布(GdGl和S期)无

4、明显差异；A549细胞球和A549细胞系处于G2／M期的细胞为(17．2士0．54)％vs(4．75+0．35)％，P<0．05；两组细胞经Cisplatin和Gemcitabine诱导凋亡24h后，A549细胞系处于S期的细胞与对照组相比有统计学意义，P<0．05；而A549细胞球处于Oo／G1和S期的比例III摘要与对照组相比无明显差异：两组细胞经Cisplatin和Gemcitabine诱导凋亡24h后，经流式细胞技术分析细胞凋亡率分别为：A549细胞球仍DP：14．64+1．23％。A549细胞系／DDP：72．16士5．63％，A5

5、49细胞球／GEM：34．38士2．94％，A549细胞系／GEM：77．32士4．73％，A549细胞球／control：4．16士1．12％，A549细胞系／control：11．83士1．56％，P<0．05。6．ImPCR、Westernblot方法检测到A549细胞球MRPl、LRP基因及GST-n蛋白的表达量较A549细胞系显著增高(P

6、室提供)皮下成瘤后，于第45天取出皮下肿瘤进行病理检查。采用荧光免疫组化法检测GST--n在成瘤组织中的表达，结果显示：GST．尢抗体阳性表达位于胞质，呈红色荧光；A549细胞球成瘤组织和A549细胞系成瘤组织中红色荧光的平均荧光强度分别为：18．53+0．77、12．54a：0．49，两者比较具有统计学差异，P<0．05。结论1．无血清悬浮培养法成功培养出A549细胞球，高表达干细胞标志物CDl33和CD44s；2．A549细胞球比A549细胞系具有更强的耐药性特性。关键词：肺腺癌；肿瘤干细胞；细胞球；无血清悬浮培养；耐药IVAbtract

7、ABSTRACTBackground：Non．smallcelllungcancer(NSCLC)wastheleadingcauseofcancer-relatedmortalityandmorbiditytreatmentfailure．Thechemoresistanceoflungcancerremainsamajorunresolvedclinicalandscientificproblem．Inrecentyears，increasingevidenceindicatesthatcancerstemcells(CSCs)arein

8、itiatorsoftheocculTence，developmentandrecurrenceofmalignanttumors．Inaddition，CSCsp