表达降钙素基因相关肽的内皮祖细胞移植治疗动力性肺动脉高压的实验的研究

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1、论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名论文使用授权声明日期：本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名导师签名日期博士学位论文表达降钙素基因相关肽的内皮祖细胞移植治疗大鼠动力性肺动脉高压的实验研究中

2、文摘要肺动脉高压(PAH)是心血管外科领域内常见的并发症，尤其见于先天性心脏病．其基本病理改变为以血管壁中膜平滑肌增生为特点的血管重构．以往研究表明肺血管壁平滑肌增殖增生是受内皮细胞旁分泌所产生的细胞因子的严密调控的．而由于肺高灌注所引起的肺动脉高压的病理改变中，肺小动脉内皮细胞往往受损、坏死及功能异常，导致局部细胞因子分泌紊乱，诱导中膜平滑肌细胞增殖增生，肺血管重构．近年来，在外周血中发现具有分化为内皮细胞潜能的内皮祖细胞，此类细胞可以迁移到受损组织局部并分化为有正常分泌功能的内皮细胞。因此内皮祖细胞可以既作为内皮组织修复工具，又可同时作为有效的目的基因载体．降钙素基因相

3、关肽(CGRP)具有强大的肺血管舒张及抑制平滑肌增殖的作用，在肺动脉高压的病理过程中其水平，以往研究证实CGRP通过与血管壁平滑肌细胞表面的OGRP受体结合，明显缓解肺动脉高压．本研究将外源性CGRP基因转染内皮祖细胞，并将携带外源CGRP基因的内皮祖细胞通过颈静脉注射给左向右分流引起的肺动脉高压的大鼠模型，观察其缓解肺动脉高压及抑制肺血管重构的治疗作用，以期为肺动脉高压的发病机制和临床治疗提供理论基础和实验依据．方法本研究采用外周血单个核细胞密度梯度离心的方法采集外周血单个核细胞，经过细胞因子的定向诱导分化，进行细胞培养至一周，利用DⅡ．acLDL，FITC-Uiex—l

4、ectin双荧光显色法及CD34，CDl33细胞表面标志物的流式细胞术(F鼬Cs)对内皮祖细胞进行鉴定．根据CGRP全长cDNA序列设计一对CGRP开放阅读框上下游引物，并分别引入EcoRI和BamHI酶切位点，以pGEM-T．CGRP为模板进行逆转录扩增反应，将PCR产物与真核表达载体pEGFP．N1进行EcoRI和BamI-II双酶切，酶切产物片段经过纯化后，进行连博士学位论文接反应后转化大肠杆菌EcoliDH5o，转化予经过质粒扩增提取后，经电穿孔法转染内皮祖细胞，通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光，并通过放射免疫方法测定细胞培养液中cGliP浓度，证实内皮祖细胞成功转染

5、外源质粒基因并且可分泌cG即。将转染细胞分成2x106cells／mL小单位准备进行静脉注射．将6．8周龄的无胸腺裸大鼠随机分成4组，分别为对照组、左向右分流组、分流+EPC移植组及分流+CGRP．EPC移植组。通过腹主动脉与相邻下腔静脉之间建立左向右分流通道，饲养10周，以完成动力性肺动脉高压动物模型的建立．以lxl06EPC．s，lxloeCGRP．EPCs(均为500uL)分别经过颈静脉注射给分流+EPC移植组及分流+CGRP．EPC移植组，继续饲养4周。以右心导管法测量各组大鼠肺动脉压力，通过热稀释方法测量肺血管阻力(PVR)，取大鼠肺叶组织，利用放射免疫方法测定肺

6、组织内以及血浆中的oGRP含量，同时提取肺组织内的RNA，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定CGRPmRNA含量．针对大鼠CD31抗原，采用小鼠抗大鼠cD31单克隆抗体结合免疫荧光技术检测EPC在肺组织内的分布。肺叶组织进行切片，HE染色，并利用计算机图象分析技术检测肺小动脉结构变化并进行组间比较，切取肺组织小块(1mmXlmmXlram)，系列脱水固定后，进行透射电镜观察各组肺小动脉壁超微结构变化．另外取24只大鼠随机分为3组，进行分流手术后分别接受EPC移植，CGRP．EPC移植，其余一组不接受细胞移植，采用Kaplan-Meier方法进行生存分析．结果1．从人

7、外周血中分离的单个核细胞经过细胞因子诱导后，3天后可见细胞伸展，并见梭形细胞；5天形成细胞集落，约一周左右形成典型的铺路石样结构，出现多个细胞团，中间为圆形细胞，贴壁的梭型细胞从细胞团的周围向外生长，第10天左右可见首尾相连形成条索状结构。荧光显微镜下可观察到同时发绿色(DⅡ．acLDL)和红色(FITC-U3ex-lectin)荧光的双阳性贴壁细胞．FACS检测，cD34阳性率为77．2％±10．9％，和ACl33阳性率为27．1％±9．1％．2．重组质粒pEGFP-N1．CGRP经酶切鉴定正确．体外经电穿孔转染