psgl1过表达内皮祖细胞移植促进缺血组织血管新生的实验研究论文

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1、第二部分Ad—PSGL一卜EPC对裸鼠缺血下肢血管新生的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·32实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．38第一部分P选择素糖蛋白配体一l重组腺病毒载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”38第：：部分腺病毒介导PSGL．1体外感染EPC的实验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41第二部分Ad—PSGL一卜EPC对裸鼠缺血下肢血管新生的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”48讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯55参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯67致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯682北京协和医学院壮础学院瞬‘I：研究生学位论文摘要下肢缺血性疾病多由动脉粥样硬化所致的动脉狭窄或闭塞引起，其最早及最常见的症状为间歇性跛行，严重者会出现缺血性静息痛、足趾缺血性溃疡和坏疽，甚至导致截肢。随着生活水平同益提高，下肢缺血性疾病的发病率亦逐年升高，严重的影响着人们的生活质量。近年来，内皮祖细胞移

3、植促进血管新生技术为患者治疗严重下肢缺血性疾病提供了一种新途径。内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell，EPC)是血管内皮细胞的前体细胞，在胚胎或成年后缺血、创伤等病理状态下参与血管的新生。但是近些年的研究发现，由于体内病理生理环境的影响，注射入体内的EPC只有很少一部分聚集到缺血部位发挥作用，因此，如何通过各种措施增加EPC归巢的数量已经成为目前研究的焦点。P选择素糖蛋白配体．1(P．selectinglycoproteinligand．1，PSGL．1)是九十年代初发现的一种粘附分子，具有同源二聚体的结构，是一种分子量为120KD的跨膜糖蛋白，表达

4、于多种白细胞的表面，如中性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞等。PSGL．1与P选择素的相互作用在介导细胞初始粘附过程中有重要作用。本研究试图探讨将PSGL．1转染到EPC后观察PSGL—l在EPC中的过表达是否有助于进一步促进EPC的血管新生作用，为EPC在促进血管新生和治疗缺血性疾病的临床应用方面提供新的研究线索。一、P选择素糖蛋白配体．1重组腺病毒载体的构建。将人P选择素糖蛋白配体．1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316，用脂质体转染法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox．E1，3Cre和穿梭质粒pDC316一PSGL．1共转染人HEK293细胞，进行同源重组并

5、包装扩增病毒。经酶切鉴定及PCR结果证明PSGL．1基因重组腺病毒载体构建成功，测序结果表明所的目的基因为PSGL．1，用HEK293细胞包装后，重组腺病毒的滴度为3．1x10¨PFU／ml。在第一部分实验中成功应用AdMaX腺病毒包装系统成功地构建了人P选择素糖蛋白配体．1重组腺病毒载体。二、腺病毒介导PSGL．1体外感染EPC的实验研究。在这一部分中我们体外原代培养大鼠骨髓EPC，并通过形态学和FITC．UEA．I和DiI．acLDL双吞噬实验鉴定内皮祖细胞，用携带PSGL．1基因的腺病毒真核载体(Ad．PSGL．1．CMV-GFP)转染第七天的EPC，并设空白对照组，流

6、式细胞仪检测转染后第2天绿色荧光蛋白(GFP)的表达率。FITC．UEA．I和DiI．acLDL荧光双染证实分化的EPCs，以MOI为100感染各组细胞24h后，荧光显微镜观察转染效率可达75％以上，未发现明显的腺病毒感染引起的凋亡，IH．PCR和Westem，免疫荧光可证实腺病毒介导的PSGL．1的基因和蛋白质在EPC中的表达明显高于对照组，PSGL．1过表达可增强3北京协和医学院基础学院铆+Jj研究生学位论义内皮祖细胞对活化内皮细胞的粘附性。通过腺病毒介导的方法基因修饰EPC初步认为细胞损伤小，转染效率高，体外PSGL。1感染EPC增加了EPC与受损伤内皮细胞的粘附，为进

7、一步在体内实验奠定了基础。三、Ad—PSGL一卜EPC对裸鼠缺血下肢血管新生的影响。建立裸鼠下肢缺血模型，术后48小时观察造模足否成功；在体外通过腺病毒感染的方法介导人PSGL一1基因(Ad—PSGL一1)入EPC，经尾静脉将Ad—PSGL一卜EPC注入下肢缺血的裸鼠；14天后通过CD31免疫组织化学的方法计算毛细血管形成的数目；激光多普勒测定下肢血流的恢复情况。结果发现裸鼠左下肢股动脉部分结扎切除术后48小时造成下肢缺血j经尾静脉移植异种Ad—PSGL一卜EPC至裸鼠鼠缺血下肢后14天，组织学上可见移