转染henos基因内皮祖细胞靶向移植治疗动力型肺动脉高压实验的研究

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1、中文摘要第一部分人内皮型一氧化氮合成酶基因重组腺病毒载体(Ad．CMV-heNOS)的构建【目的】构建携带人内皮型一氧化氮合成酶基因的重组腺病毒载体Ad．CMV-heNOS，同步构建携带报告基因——增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Ad．CMV．EGFP。【方法】将hcNOS基因插入载体PSUCMV中构建重组质粒PSUCMV．heNOS，后者经酶切及测序鉴定正确后与5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine2000共转染至293细胞，制备携带人内皮型一氧化氮合成酶基因的重组腺病毒载体Ad．CM

2、V-heNOS，鉴定正确后体外扩增、纯化并测定滴度。同法构建重组腺病毒载体Ad．CMV．EGFP并测定滴度。【结果】重组质粒PSUCMV-heNOS经酶切及测序鉴定正确。PCR检测证实PSucMV-heNOs与Pbhge3共转染293细胞所得腺病毒载体Ad．CMV-heNOS构建成功，经扩增纯化后测定病毒滴度为5．15×109pfu／ml。同法构建的Ad．CMV-EGFP滴度为3．8×109pfu／ml。【结论】成功构建并纯化得到了高滴度重组复制缺陷型腺病毒载体Ad．CMV-heNOS和Ad．CMV-EGFP，为后续

3、实验中高效基因转染做好准备。【关键词】内皮型一氧化氮合成酶基因，腺病毒载体，基因治疗第二部分大鼠骨髓内皮祖细胞分离、培养和鉴定的实验研究【目的】研究大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC)分离、培养并向内皮细胞方向诱导分化的方法和条件。【方法】从大鼠骨髓中通过密度梯度离心法分离单个核细胞，经差速贴壁后取二次贴壁细胞选择性诱导培养2w。以Dil—ac．LDL、FITC．UEA．1X荧光染色法以及vWF、Flk-1免疫荧光染色法鉴定EPC；流式细胞术(FACS)检测EPc纯度：细胞培养液一氧化氮(NO)含量测定分析EPC功能。【结果

4、l二次贴壁细胞经诱导培养后3d开始伸展，5d形成集落，7-10d：噌殖加速并出现条索状结构，2w大部分细胞呈多角形。Dil—ac．LDL、FITC．UEA．1双染，vWT及Flk-1免疫荧光染色阳性率均大于70％。FACS检测其q，vWF阳性细胞&77．93％，Flk一1阳性细胞占81．50％。二次贴壁并经诱导培养的细胞培养液中N0含量明显高于中文摘要普通培养的细胞，但低于成熟内皮细胞(P

5、髓，内皮祖细胞，分化，大鼠第三部分大鼠动力型肺动脉高压模型的建立【目的】研究不同比例肺组织切除后对大鼠体、肺动脉压、右心室肥厚程度和肺血管重构的影响，以期建立一种新的大鼠动力型肺动脉高压模型。【方法】68只8w龄Wister大鼠分为右肺全切除组(组I)、左肺全切除组(组II)、右肺上中二叶切除组(组HI)、假手术组(组1V)和阴性对照组(组V)。手术后4w测定各组大鼠体、肺动脉收缩压，检测右心室肥厚指标(RV／(Lv+S))以及肺血管显微形态学指标——肺肌型小动脉相对中膜面积(RMA)及其占肺小血管的百分比(SMA％

6、)。【结果】组I大鼠4w后存活率66．7％(12／18)，存活大鼠体重较组Ⅳ、V减轻(P<0．05)。组I肺动脉收缩压、RV／(L、，+s)、RMA及SMA％均明显高于其它四组(P．<0．01)；组II、组IH之问各指标无显著性差异(P>O．05)：组Ⅳ、V之间各指标也无显著性差异(P>O．05)；组IIRMA明显高于组Ⅳ、V(P<0．05)；组III肺动脉收缩压和RMA均明显高于组Ⅳ、V(P<0．05)；五组大鼠体动脉收缩压无显著性差异(P>0．05)。【结论】大鼠右肺全切除术后4w可形成明显肺动脉高压、右心室肥厚

7、和肺小血管重构，而对体动脉压影响不大。与其它动力型肺动脉高压模型相比，该法操作简便，死亡率较低，实验周期较短，具有一定的应用价值。而左肺全切除和右肺上中二叶切除术后4w肺动脉压和肺血管结构虽有一定的变化，但相对不明显。【关键词】肺切除，动力型肺动脉高压，血管重构，豸丽第四部分Ad．CMV-heNOS体外转染内皮祖细胞，并抑制离体平滑肌细胞增殖的实验研究【目的】了解重组腺病毒载体对大鼠骨髓来源EPC的转染效率，观察Ad．CMV-heNOS转染EPC后heNOS基因的表达情况以及对离体平滑肌细胞(SMC)增殖的影响。【方

8、法】以不同MOI值的腺病毒载体Ad．CMV-EGFP体外转染EPC，流式细胞中文摘要仪(FACS)检测转染阳性率。Ad．CMV-heNOS以MOI=50转染EPC后，RT-PCR检测细胞中heNOSmRNA的转录水平，免疫组化染色法、Western．Blot法检测heNOS蛋白的表达水平，硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO水平。将EPC按干预方式