cyclin+d1+sirna对肺腺癌a549细胞体内外增殖和侵袭转移的影响研究

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1、第三军医大学硕七学位论文CyclinD1siRNA对肺腺癌A549细胞体内外增殖和侵袭转移的影响研究摘要背景与目的肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，近年来大量新的化疗药物和治疗手段用于中晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗，但疗效仍然不佳，中晚期NscLc的5年生存率小于10％。cyclinD1是一种原癌基因，在细胞周期G1／s转换、肿瘤细胞的转化及侵袭能力、肿瘤的预后中起重要作用。本实验设计了以CvclinD1基因为靶标的siRNA干扰载体，观察其对肺腺癌A549细胞体内外增殖和侵袭转移的影响，为进一步应用于肺癌的实验性基因治疗研究提供实验依据。研究方

2、法1．应用免疫组化S—P法检测58例非小细胞肺癌(NSCLC)和15例正常肺组织中CyclinD1及相关基因NF—KBp65、P27的表达。2．设计并构建了针对CyclinD1mRNA的3条CyclinD1siRNA质粒表达载体hCCNDll、hCCNDl2、hCCNDl3和一条无关对照序列表达载体hK，用脂质体法将hK和hCCNDll、hCCNDl2、hCCNDl3分别转染人肺腺癌A549细胞，48h后用RT．PCR和westemblot技术检测各实验组A549细胞内CyclinD1mRNA及蛋白的表达情况，筛选出有效序列。3．经G418筛选出稳定转染hCCNDl3

3、表达载体的A549细胞，用RealtimePCR和Westernblot检测CvclinD1、MMP．2mRNA和蛋白表达，免疫荧光检测RhoA、Racl蛋白的表达，以噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪、软琼脂糖克隆形成实验、细胞体外侵袭实验(transweu小室)测定干扰后A549细胞周期、增殖、体外侵袭能力。采用背部皮下种植建立裸鼠移植瘤模型和腹腔内种植建立转移模型，检测各组A549细胞体内生长和转移能力，免疫组化检测肿瘤组织CyclinDl、MMP．2、RhoA和Racl蛋白的表达。结果1．NSCLC组织CyClinD1的过表达率为74．1％(43／58)；Cy

4、clinD1的表达与瘤体大’国家自然科学基金资助编号(30772144)6第三军医大学硕士学位论文小、组织分化、淋巴结转移、临床分期密切相关(P

5、定转染的A549细胞。hccNDl3组A549细胞中CyclinD1mRNA和蛋白的表达抑制率分别为72％和65％，CyclinD1蛋白表达降低后MMP．2、RhoA和Racl蛋白表达也出现下降，A549细胞CyclinD1表达下降后细胞群体中Go～Gl期细胞比例由52．3％增加至71．7％。并且A549细胞体外增殖抑制率达40％，细胞克隆数(39．O±3。6)相对于空白对照组(82．3±4．9)下降了53％，穿膜细胞数也出现明显下降，hCCNDl3组减少了62％(尸<0．01)。成功建立裸鼠移植瘤模型和转移模型，空白对照组细胞平均成瘤时间为7．3±0．9天，hCCN

6、Dl3组增加为12．1±O．8天，移植瘤体内生长曲线显示hCcNDl3组的肿瘤生长抑制率达到48％。肺和淋巴结转移率明显下降，hCCNDl3组移植瘤组织cyclinD1、MMP一2、RhoA和Racl蛋白表达明显下降(P<0．05)。结论1．CvclinD1及其关联基因NF—KB、P27的表达异常共同促进了NSCLC的发生发展，CyclinDl的过表达促进了NSCLC细胞的增殖和侵袭转移。因此，通过干预CyclinD1的过表达，有可能抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭转移。2．成功构建和鉴定了针对CyclinD1的RNA干扰表达载体hcCNDll、hCCNDl2、hCCN

7、Dl3，发现hCCNDl3表达产物能有效抑制CyclinD1在A549细胞中的表达，为进一步将hCCNDl3应用于肺癌的实验性基因治疗研究奠定了基础。3．hCCNDl3表达产物能有效抑制人肺腺癌A549细胞在体内外的增殖、侵袭和淋巴结转移；其抗增殖机制与该表达载体表达产物能特异地干扰A549细胞CyclinD1的表达，使A549细胞阻滞于GI期，负性调控细胞周期密切相关；其抗侵袭转移机制可能与该表达载体表达产物显著下调MMP一2、Racl和RhoA的表达密切相关。关键词：CyclinD1；RNA干扰；A549细胞；增殖；侵袭；转移第三军医大学硕士学位