高产ε聚赖氨酸白色链霉菌的原生质体诱变选育与发酵的研究

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1、摘要高产￡．聚赖氨酸白色链霉菌的原生质体诱变选育及发酵研究学科、专业：食品科学入学时间：2007．09．01硕士研究生姓名：程传荣答辩时间：2009．12．09指导教师：陈卫教授授予学位时间：摘要￡．聚赖氨酸(￡．poly．L．1ysine，￡．PL)是由微生物合成的一种氨基酸同型聚合物，由人体必需氨基酸L．赖氨酸的￡．氨基和另一L．赖氨酸的a．羧基形成的酰胺键连接而成。￡．PL具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、耐热芽孢杆菌和一些病毒都有抑制作用，且具有水溶性好、热稳定性高等特点，是一种安全高效的

2、天然生物防腐剂。目前￡．PL被广泛用于食品防腐保鲜、可降解生物材料以及医学研究中。为了建立一种快速方便的￡．聚赖氨酸检测方法，本文基于￡．聚赖氨酸与Dragendorff's试剂的沉淀复合物可与硫脲产生显色反应，提出了一种利用分光光度计快速检测￡．聚赖氨酸的新方法。￡．聚赖氨酸含量与反应复合物吸光度在pH2．0～5．O，反应时间在45min以内，具有较高的线性相关性。分光光度计测定波长为435nm。浓度在0～1．509／L范围内，￡．聚赖氨酸工作曲线线性相关系数为R2=O．9999，RSD=3．63％，检出限为0．

3、019／L。该方法相比于Itzhaki法具有较高的准确性。最后以该方法为依据建立了一种利用96孔板高通量快速检测￡．聚赖氨酸的方法。对白色链霉菌UN2．71的原生质体进行了制备和再生。确定了白色链霉菌UN2．71原生质体制备和再生的最优条件，即在含甘氨酸2％的菌丝培养基中培养48h，收集菌丝体经2．0mg／mL的溶菌酶，在30℃下酶解60min，可获得大量的原生质体。以白色链霉菌UN2．71为出发菌株，进行了原生质体的DES诱变实验。首先研究了不同剂量的DES对结果的影响，然后绘制了致死率曲线，确定了0．1％DES

4、，诱变38min和0．15％DES诱变18min最适诱变剂量。挑取了514株再生菌落，应用摇试管培养和高通量快速测定方法初筛得到26株高产菌，经过复筛最终得到了一株高产菌株D3．32，￡．聚赖氨酸产量达到1．569／L，比出发菌株提高了49．43％。经传代发酵试验，该突变株遗传性状稳定。采用2．3L自动发酵罐，研究了突变菌株D3．32和原始菌株的发酵特性，可以得出突变株的菌体生长能力更高，￡．聚赖氨酸合成能力更高。调控pH4．0，有利于产物￡．聚赖氨酸的合成。突变株D3．32经2．3L自控发酵罐发酵，发酵过程中调控

5、pH4．0，发酵后期补充葡萄糖和硫酸铵，补料分批发酵并调控pH，采用不断补充碳源来延长发酵周期，发酵体系中菌体浓度达到了31．589／L，而￡．聚赖氨酸的产量则达到8．069／L，比原始菌株自然发酵下提高了近5倍。最后初步研究了发酵液中￡．聚赖氨酸的抑菌活性。关键词：￡．聚赖氨酸，白色链霉菌，生物防腐剂，原生质体诱变，发酵AbstractProtoplastMutationBreedingofHigh￡-polylysine--producingStreptomycesalbulusandstudiesonFerm

6、entationSubjectandSpeciality：Engineering，FoodScienceTimeofenrollment：01-09—2007Mastergraduatestudent：ChuanrongChengTimeofdefense：00·-12--2009Facultyadviser：WeiChen，ProTimeofconferringdegree：e-poly—L—lysine(e—PL)isahomo—poly—aminoacidcharacterizedbythepeptidebo

7、ndbetweenthea-carboxylande-aminogroupsoftheessentialaminoacidL—lysine．Itshowsawiderangeofantimicrobialactivityagainstmostgram-positiveandgram-negativebacteria，fungiandalsosomeviruses．Inaddition，￡-PLissolubleandattractiveheatstable．Atpresent，￡-PLhasbeenusedasfo

8、odpreservativemainly,degradablebiologicalmaterialandmedicalresearch．Inordertodevelopanewrapidandconvenientdetectionmethod，basedonthecolorreactionofthioureaandprecipitedcomplexofe-P